摘要：目的利用成簇的规律间隔的短回文重复序列/Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9)技术构建稳定敲除G蛋白偶联受体43(GPR43)基因的RAW264.7细胞系,探究GPR43基因在肺炎克雷伯菌感染过程中的作用机制。方法设计3对针对GPR43基因的小导向RNA(sgRNA),将sgRNA插入pLenticrisprV2质粒中,利用慢病毒包装系统包装含有sgRNA的重组质粒pLenticrisprV2;将病毒感染RAW264.7细胞,嘌呤霉素筛选单克隆细胞;将扩增的单克隆细胞提取基因组DNA,测序GPR43基因相关序列并与野生型GPR43基因进行比对,确认敲除成功的细胞株(GPR43^-/-RAW264.7细胞),Western blot法检测GPR43蛋白水平。肺炎克雷伯菌感染GPR43^-/-RAW264.7细胞,实时定量PCR法检测细菌感染后细胞内白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6和肿瘤坏死因子α(TNF-α)表达水平的变化,并观察敲除GPR43后,RAW264.7细胞吞噬能力的变化。结果挑选的单克隆细胞经Western blot验证GPR43蛋白不表达,并且DNA测序结果显示在sgRNA插入位置缺失34个碱基,证明成功敲除GPR43基因。GPR43^-/-RAW264.7细胞感染肺炎克雷伯菌后,细胞中的IL-1β、IL-6和TNF-α表达水平均低于对照组,且GPR43^-/-RAW264.7细胞对肺炎克雷伯菌的吞噬能力降低。结论CRISPR/Cas9技术敲除GPR43基因,抑制其对肺炎克雷伯菌的吞噬功能及炎性细胞因子的产生。

摘要：采用CRISPR-Cas9基因编辑技术,构建G-蛋白偶联受体41(gpr41)基因敲除的RAW264.7细胞系。利用慢病毒转染,构建稳定表达Cas9蛋白的巨噬细胞株。针对gpr41基因作用的功能区域,设计靶向gpr41基因的向导RNA(gRNA),构建pLenticrisprV2重组质粒转化DH5α感受态细胞,筛选出重组子测序验证gRNA的有效性。鉴定成功的pLenticrisprV2-gpr41-gRNA重组质粒采用转染试剂转染巨噬细胞系RAW264.7。筛选阳性单克隆细胞株,Western blot检测gpr41基因的表达。测序结果证实pLenticrisprV2-gpr41-gRNA重组质粒构建成功;Western blot筛选出重组质粒pLenticrisprV2-gpr41-gRNA3转染RAW264.7细胞13号单克隆株的GPR41蛋白不表达。利用CRISPR-Cas9基因编辑技术成功构建了gpr41基因敲除的巨噬细胞株,为研究gpr41基因在RAW264.7细胞中的作用机制奠定基础。

摘要：为实现对河南油田安棚深层系和泌阳凹陷等区块中多层系及大跨度储层的低成本多级压裂增产措施,研制了一种多级压裂自助解封封隔器及其工艺管柱。该管柱主要由多级压裂自助解封封隔器和滑套喷砂节流器等工具组成。其中多级压裂自助解封封隔器设计了自助解封机构,压裂后可快速解封,消除了多级分层压裂易砂卡管柱的问题,同时具有良好的耐高温高压性能。滑套喷砂节流器设计了耐磨级差滑套,可实现投球打滑套分层压裂。5口井的现场试验证明,设计的工艺管柱耐温耐压性能良好,解封安全可靠,能满足河南油田多层油井1趟管柱分层改造的需要,具有良好的推广应用前景。

摘要：目的构建针对晚期内含子/溶酶体适配子和促分裂原活化蛋白激酶以及哺乳动物重组雷帕霉素激活物分子2(late endosomal/lysosomal adaptor,mitogen-activated protein kinase and mammalian target of rapamycin activator 2,lamtor2)基因的小发夹RNA慢病毒载体,探讨RNA干扰lamtor2基因表达后对肺炎克雷伯菌感染引起的巨噬细胞中炎性因子分泌的调控作用.方法针对小鼠lamtor2基因设计2对小发夹RNA(shlamtor2),重组构建慢病毒载体pLKO.1-puro shlamtor2,并感染小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞.设2个实验组,pLKO.1-puro shlamtor2-1感染组(sh1组)和pLKO.1-puro shlamtor2-2感染组(sh2组),以空载pLKO.1质粒感染RAW264.7细胞为对照组.通过实时定量PCR和蛋白质印迹法检测各组细胞中lamtor2基因表达.肺炎克雷伯菌感染sh2组细胞,采用实时定量PCR方法检测细菌感染后细胞内白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α表达水平的变化.2组间比较采用t检验.结果重组慢病毒颗粒pLKO.1-shlamtor2感染RAW 264.7细胞后,对照组lamtor2基因mRNA相对表达量为1.000±0.000,sh1组为0.596±0.125,sh2组为0.120±0.080,sh2组的lamtor2表达量低于sh1组,差异有统计学意义(t=3.399,P=0.015),且sh1组和sh2组的表达量均低于对照组,差异均有统计学意义(t=3.333、9.734,均P<0.05).以肺炎克雷伯菌感染的野生RAW 264.7细胞作为对照,sh2组细胞感染肺炎克雷伯菌后,细胞中的IL-1β(t=15.20)、IL-6(t=43.30)和TNF-α(t=12.67)表达水平均高于对照组(均P<0.01).结论针对lamtor2基因的小发夹RNA可通过RNA干扰机制稳定下调巨噬细胞中lamtor2基因的表达,基因下调对感染了肺炎克雷伯菌的巨噬细胞内的炎性因子的分泌有明显的促进作用.