摘要：为了建立一种特异、灵敏、快速、重复性好和检测成本低的羊口疮病毒检测方法,试验根据GenBank中羊口疮病毒(登录号为AY386264)ORFVgORF102基因DNA序列,应用Beacon Designer7.0软件设计、合成了1对SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR引物。结果表明:经反应条件优化后,建立了羊口疮病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR,最佳引物浓度为400 nmol/L,最佳模板浓度为3.61～36.1 ng/μL或2.385×107～2.385×108copies/μL;该方法组内及组间变异系数均小于2%,检测灵敏度可达到3.61 pg/μL或2.385×104copies/μL,上机检测时间不超过1 h;运用该方法对2份临床样品进行定量检测,样品抽提DNA中病毒拷贝数分别为1.4×109copies/μL和8.7×108copies/μL。说明试验所建立的羊口疮病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR具有特异、灵敏、快速、重复性好和检测成本低等优点,适合于羊口疮病毒临床样品的检测。

摘要：为实现山羊两种疫病病原体——羊口疮病毒(ORFV)和山羊痘病毒(GTPV)的同步快速检测,基于ORFV的025基因及GTPV的ITR基因,分别设计用于普通双重PCR的引物两对、用于双重实时荧光定量PCR的特异性引物及探针两套。试验结果显示,所建立的ORFV-025/GTPV-ITR-S双重普通PCR方法,可实现对GTPV与ORFV的特异性双重检测,检测敏感度可达104拷贝/μL DNA;所建立的025-ITR二联探针实时荧光定量PCR方法亦可同时特异性检测ORFV和GTPV产生特异性荧光信号,二联探针的检测敏感度可分别达102.71拷贝/μL和102.88拷贝/μL DNA。本研究初步建立了可同步快速特异性检测ORFV和GTPV的双重普通PCR及二联实时荧光定量PCR检测方法。

摘要：为同时检测小反刍兽疫病毒(PPRV)、裂谷热病毒(RVFV)及施马伦贝格病毒(SBV) 3种外来动物疫病病原,根据GenBank相关病毒序列设计引物及探针,建立PPRV、RVFV、SBV三重普通RT-PCR及三重实时荧光定量RT-PCR检测方法,并初步应用于临床检测。结果显示:所建立的PPRV、RVFV、SBV三重普通RT-PCR方法可同步特异性检测PPRV、RVFV、SBV,检测敏感度可达10~3 copies/μL DNA;对临床症状相似的羊痘、羊口疮、口蹄疫、阿卡斑、蓝舌病及鹿流行性出血热等病毒未有扩增。所建立的PPRV、RVFV、SBV三重实时荧光定量RT-PCR方法对PPRV、RVFV、SBV有特异荧光信号,检测敏感度可达10~(1.33)~10~(2.13) copies/μL DNA;而对临床症状相似羊痘、羊口疮、口蹄疫、阿卡斑、蓝舌病及鹿流行性出血热等病毒未有荧光信号。应用PPRV、RVFV、SBV三重实时荧光定量RT-PCR方法检测925份临床样本,检出一例PPRV阳性样本,经常规RT-PCR扩增及序列测定Blast确定为PPRV谱系IV型毒株。研究所建立的PPRV、RVFV、SBV三重普通RT-PCR方法和三重实时荧光定量RT-PCR方法可同步特异性检测3种病原,并初步应用于临床样本的检测。

摘要：为对采集自昆明某大型牲畜交易市场的一例PPRV阳性鼻拭子样本进行追根溯源,设计引物采用RT-PCR方法进行PPRV病毒基因组关键基因N、P、M、F、H核苷酸序列扩增,并进行序列测定和遗传进化分析。结果显示:N、P、M、F、H基因均有预期片段扩增,其读码框(ORF)长度分别为1 578、1 531、1 008、1 641及1 830 nt;N、P、M、F及H构建的遗传进化树均显示所测毒株为基因Ⅳ型,同2013年在新疆伊犁山羊中检测到的毒株(KM091959)同源性最高,N、P、M、F、H核苷酸同源性分别为99.2%、99.0%、99.4%、99.6%和99.3%,推断氨基酸同源性分别为98.7%、98.4%、100.0%、99.8%和99.3%。研究表明,检测到的毒株仍为2013~2014年我国PPRV流行期的基因Ⅳ型毒株,变异较小;所测毒株的N、P、M、F、H 5个关键基因中,M基因最保守、其次是F/H基因,而N、P基因略有变异。

摘要：为建立一种快速、准确检测猪溶血性曼氏杆菌TaqMan荧光定量PCR方法,根据溶血性曼氏杆菌16S rRNA基因保守序列设计种特异性引物及探针,优化反应条件,建立了检测溶血性曼氏杆菌的TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果表明,以重组质粒pMD-MH-16S为标准品建立的标准曲线在3.06×10^8-3.06×10^1copies/L范围内具有良好的线性关系,最低可以检测到3.06×10^1 copies/L的标准品阳性质粒。该方法与其他24种常见细菌均无交叉反应,批内和批间变异系数均小于3%。应用建立的方法和普通PCR方法对65份临床样品进行检测,阳性率分别为56.92%和21.54%,阳性符合率为100%。本研究结果表明,所建立的方法可用于牛、羊溶血性曼氏杆菌感染的高通量快速诊断以及溶血性曼氏杆菌的快速鉴定及定量分析。

摘要：为建立化脓隐秘杆菌(***)和溶血性曼氏杆菌(***)快速核酸检测方法,本研究根据化脓隐秘杆菌和溶血性曼氏杆菌16S rRNA保守序列设计2对特异性引物及2条TaqMan探针。经对反应体系和反应条件进行优化,建立了化脓隐秘杆菌和溶血性曼氏杆菌双重TaqMan荧光定量PCR检测方法。特异性结果显示,该方法与金黄色葡萄球菌、停乳链球菌、肠炎沙门菌和大肠杆菌等22种常见细菌无交叉反应;敏感性试验结果显示,该方法对化脓隐秘杆菌和溶血性曼氏杆菌质粒标准品的最低检出浓度分别为31 copies/μL和65 copies/μL,且变异系数小于3%。对45份临床肺样品的检测结果显示,化脓隐秘杆菌和溶血性曼氏杆菌的阳性率分别为15.5%和24.4%。本研究建立的双重荧光定量PCR方法为牛羊化脓隐秘杆菌和溶血性曼氏杆菌感染的检测提供了敏感、快速的方法。

摘要：本研究试验地位于河北廊坊中国农业科学院国际农业高新技术产业园北京畜牧所试验基地,采用温室盆栽的试验方法,探讨不同水肥处理对紫花苜蓿(Medicago sativa L.)的营养成分的影响,试验采取完全随机设计,设置4种施肥梯度与3种灌水梯度。结果表明:不同水肥处理对苜蓿的N、P、K含量有显著影响,紫花苜蓿的N、P、K含量都随着施肥量的增大而增加;紫花苜蓿的全年产量与苜蓿的含磷量呈极显著正相关。紫花苜蓿的粗蛋白、粗脂肪含量随着施肥量的增大而增加,而降低了苜蓿的酸性洗涤纤维含量、中性洗涤纤维含量,结合几项指标可知,增加施肥量与高水处理即250kg·hm^(-2)的施肥量与85%~90%田间持水量,可以提高苜蓿的品质。

摘要：本研究以呼伦贝尔天然羊草草原退化打草场为研究对象,分析蚯蚓粪和菌渣有机肥对退化草地的响应机制,研究不同处理对草原植物群落特征、生物量和物种多样性的影响。试验采用单因素随机区组设计,设置对照,蚯蚓粪45t·hm^(-2),30t·hm^(-2),15t·hm^(-2),菌渣45t·hm^(-2),30t·hm^(-2),15t·hm^(-2)共7个处理。结果表明:施用菌渣和蚯蚓粪45t·hm^(-2)时地上生物量和群落盖度较对照显著提高(P<0.05),草原植物群落特征和物种多样性明显增加。有机肥对天然草地的恢复有一定促进作用,对羊草草原植物群落物种多样性和地上生物量有显著影响,其中菌渣和蚯蚓粪45t·hm^(-2)施肥量时改良效果较好。

摘要：为建立一种快速鉴别检测致病性与非致病性溶血性曼氏杆菌的双重TaqMan荧光定量PCR方法,根据溶血性曼氏杆菌16S rRNA和白细胞毒素(lktA)基因保守序列设计特异性引物及探针,并优化反应条件,建立了鉴别致病性与非致病性溶血性曼氏杆菌的双重TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果显示:所建立的双重TaqMan荧光定量PCR方法与其他24种常见牛羊细菌均无交叉反应,具有较好的特异性;其检测lktA基因阳性和阴性溶血性曼氏杆菌的最低检出限度均为40 copies,具有较好的敏感性。应用建立的双重荧光定量PCR方法和普通PCR方法对48份临床样品进行检测,这2种方法检出的溶血性曼氏杆菌阳性率分别为27.1%和18.8%,检出lktA基因阳性溶血性曼氏杆菌的阳性率分别为20.8%和12.5%,阳性符合率为100%。本研究中建立的双重荧光定量PCR方法为牛羊溶血性曼氏杆菌致病性与非致病性菌株感染的高通量快速鉴别诊断提供了可行手段。

摘要：为建立产气巴氏杆菌(***)的快速检测方法,本研究根据*** 16S rRNA基因的保守序列设计引物及TaqMan探针,并优化反应体系和反应条件,建立了*** TaqMan荧光定量PCR检测方法。建立的TaqMan荧光定量PCR方法的标准曲线结果显示,质粒标准品在4.7×10^(6)拷贝/μL~4.7×10^(1)拷贝/μL和Ct值之间的线性关系良好,相关系数R2为0.992,扩增效率为98.29%。利用建立的TaqMan荧光定量PCR方法对***、溶血性曼氏杆菌、大肠杆菌和肠炎沙门氏菌等36种常见猪、牛、羊细菌病原检测均为阴性结果,特异性强;该方法对重组质粒标准品pMD19-PA的最低检测限为47拷贝/μL,敏感性高;该方法批内、批间重复性试验的变异系数在1.58%~2.55%,重复性好。利用建立的TaqMan荧光定量PCR和细菌分离方法对46份流产猪、牛和羊胎儿的样品进行***检测,结果显示前者的阳性检出率为23.91%(11/46),传统分离方法的阳性率为15.22%(7/46),两种方法总符合率为91.30%。本研究首次建立***的荧光定量PCR检测方法,为猪、牛和羊***的感染提供了敏感、快速和高通量检测方法。