摘要：背景：采用多种人工合成材料构建的组织工程皮肤，存在着创面愈合后不耐受摩擦、瘢痕增生及挛缩严重、缺乏皮肤附件等不足。而表皮干细胞尽管在体内可无限增殖分化以维持皮肤更新，但在体外普通培养条件下易发生终末分化。目的：为获得稳定生长的鼠表皮干细胞，拟建立或完善能够调控其增殖分化的体外培养体系。设计、时间及地点：细胞观察，于2007—05／11在广州市创伤外科研究所完成。材料：清洁级1～3d龄Wistar大鼠20只用于制备表皮干细胞。方法：采用两步酶消化法获得单个表皮细胞悬液，Ⅳ型胶原快速贴壁法分选贴壁细胞，加入含胎牛血清、0．05mmol／LCaCl2及表皮细胞生长因子、腺苷、胰岛素、氢化可的松、霍乱毒素等复合的DMEM培养基进行培养，原代分离细胞时胎牛血清体积分数为0．2以维持细胞活性，第2次换液时改为0．1。主要观察指标：光镜下观察细胞生长情况，免疫组化法检测目的细胞角蛋白19和P63整合素的表达，流式细胞仪检测01整合素和CD71的表达，通过细胞周期及生长曲线观察其增殖能力。结果：①Ⅳ型胶原筛选的细胞在复合DMEM培养基中生长良好，细胞活性〉98％，培养6d后形成含100～200个细胞的大克隆，呈鹅卵石样铺满瓶底。②角蛋白19和P63均呈阳性表达，β1整合素表达率为98.57％，CD71表达率为9．05％。③94．99％细胞处于GdG，期，细胞呈指数增长。结论：两步酶消化＋Ⅳ型胶原快速黏附法可成功分选稳定生长的鼠表皮干细胞。含霍乱毒素、腺苷、胰岛素等因子的复合DMEM培养基可维持表皮干细胞的增殖能力，其中合适的血清浓度及Ca^2＋浓度至关重要。