摘要：为快速准确地鉴定和区分烟草生产中的4种土传病害病原菌-青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)、软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum)、寄生疫霉(Phytophthora parasitica)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum),通过设计和筛选特异性引物,建立多重PCR反应体系,并对体系中的引物用量和退火温度进行优化,检测优化后体系的特异性和灵敏度,验证其在烟草组织、土壤样品及种子样本中病原菌检测的实用性。结果表明,反应体系中最优的引物用量组合为RsRipNTF3/RsRipNTR3各0.9μL、PccTF4/PccTR4各0.6μL、PpRhTF1/PpRhTR1各1.2μL和FoP450TF1/FoP450TR1各0.8μL,最佳退火温度为61.1℃。该体系可分别扩增出4种病原菌的特异性片段,大小分别为511、361、669和840 bp,对病原菌DNA的检测灵敏度可达50 pg·μL^(-1)。植物组织和土壤样本检测结果表明,所建立的多重PCR检测方法能够准确地检测出其中的病原菌;采用该检测方法对80份烟草商品种进行检测,发现其中4个样本携带有青枯雷尔氏菌或尖孢镰刀菌,而未检测到软腐果胶杆菌和寄生疫霉。本研究建立的多重PCR检测方法可以灵敏、准确、高通量检测4种烟草土传病原菌,为烟草土传病害的准确诊断和早期防控提供可靠的技术方法。

摘要：为建立芋疫霉Phytophthora colocasiae快速准确的分子检测方法,基于Ypt1基因特异序列,设计芋疫霉的特异性引物与探针,建立一种快速、准确、可视化的芋疫霉重组聚合酶扩增结合侧流层析试纸条(recombinase polymerase amplification-lateral flow dipstick,LFD-RPA)检测方法,对该检测方法进行优化,评估其特异性与灵敏度,并对田间疑似样品进行检测。结果表明,优化后的芋疫霉LFD-RPA检测方法最适反应条件为39℃恒温反应30 min。LFD-RPA检测方法能够特异性地检测出芋疫霉,而对其他卵菌近缘种和常见植物病原真菌均未检出,且该检测方法对芋疫霉DNA的检测灵敏度达到1 pg/μL。对田间带病组织检测发现,LFD-RPA检测方法能够快速准确地从田间自然发病植株中检测出芋疫霉。表明本研究所建立的芋疫霉LFD-RPA快速可视化检测方法特异性好、灵敏度高、简单快捷,可用于芋疫病的田间快速诊断。

摘要：番石榴焦腐病是台湾入境大陆水果的重要植物病害,由葡萄座腔菌Botryosphaeria rhodina引起。为建立该病原菌快速、灵敏的检测技术,比较分析了葡萄座腔菌和葡萄座腔菌属其它种的ITS序列,在此基础上设计了1对检测番石榴焦腐病菌的特异性引物BF1/BR1,利用此引物从葡萄座腔菌中特异性扩增出287 bp条带,而其余参试的菌株未能获得扩增条带。将真菌通用引物ITS1/ITS4和BF1/BR1进行巢式PCR扩增后,检测灵敏度提高1 000倍,可检测到葡萄座腔菌1 pg的基因组DNA。结合快速碱裂解法提取发病组织的DNA,采用该PCR检测技术可从自然感染焦腐病果实中检测到葡萄座腔菌。

摘要：利用真菌通用引物ITS1和ITS4扩增马铃薯晚疫病菌转录间隔区并进行序列测定,通过序列比较,设计了1对马铃薯晚疫病菌的特异引物INF1/INF2,并对15种不同真菌、细菌和7种疫霉属和腐霉属卵菌基因组DNA进行PCR扩增,结果只有不同来源的马铃薯晚疫病菌株可获得324 bp的特异带。将引物INF1/INF2与卵菌通用引物进行巢式PCR扩增后,其检测灵敏度在DNA水平上可达30 fg。运用设计的引物与马铃薯青枯病菌特异引物结合建立了双重PCR体系,能从马铃薯晚疫病菌和马铃薯青枯病菌总基因组DNA以及人工接种和自然发病的马铃薯植株中分别或同时扩增到324 bp和281 bp的特异片段。实现了同时对马铃薯晚疫病菌和马铃薯青枯病菌的快速可靠检测。

摘要：本研究以豇豆疫霉Phytophthora vignae Purss核糖体内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列为靶标片段,设计4条特异性引物,建立了环介导等温扩增(LAMP)检测方法。特异性检测结果表明:8株不同地理来源的豇豆疫霉菌株LAMP检测均为阳性(绿色),扩增产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳出现特有的梯形条带,而其他11种卵菌近缘种及12种常见病原真菌和细菌共42个菌株均未观察到这些现象。灵敏度分析显示:该方法检测灵敏度在DNA水平上可达到100fg/25μL。采用LAMP方法对福建建瓯和宁德采集的62份疑似豇豆疫病病株样本进行检测,并用组织分离方法进行验证。结果表明,LAMP和组织分离方法的检出率分别为67.7%(42/62)和61.3%(38/62)。综合以上结果,LAMP方法具有特异性强、灵敏度高、快速高效、操作简单的特点,适合基层部门用于田间豇豆疫霉快速检测。

摘要：以钙黄绿素(calcein)为指示剂,建立了番石榴焦腐病菌(Botryosphaeria rhodina)的环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)可视化快速检测方法。在该方法中,以番石榴焦腐病菌特异的核糖体转录间隔区(Internal transcribed spacer,ITS)序列为目的 DNA片段,设计4条引物(2条内引物、2条外引物),优化LAMP反应条件和反应体系,并进行特异性和灵敏度验证。研究确定最佳反应温度为64℃,反应时间1 h;特异性检测结果显示,15株不同地理来源的番石榴焦腐病菌和10份番石榴焦腐病病果组织LAMP产物均为阳性(绿色),而26株其它病原菌及10份健康番石榴果实组织LAMP产物均为阴性(橘黄色);灵敏度验证结果显示,该方法的检测灵敏度在DNA水平上可达到10 pg。实验结果表明,快速、准确、灵敏的LAMP检测方法适合基层部门及田间检测番石榴焦腐病菌使用。

摘要：黄曲霉Aspergillus flavus产生的黄曲霉毒素是一类毒性极强的物质,严重威胁到人类健康和经济发展,因此建立一套快速、准确、灵敏的黄曲霉检测方法就显得极为迫切。通过以aflP(GenBank:FN398191)为分子靶标,比较黄曲霉菌近缘种aflp的基因序列,以特异性序列为靶标设计2对PCR引物aflP-1-F/aflP-1-R和aflP-2-F/aflP-1-R,由此建立的PCR检测体系对7种黄曲霉菌、5种其他的曲霉菌、21种其他真菌cDNA进行扩增,结果只有在7种黄曲霉菌株中扩增出211bp的特异性条带,而其余参试菌株均无扩增产物。巢式PCR能使其检测灵敏度达到10fg,检测灵敏度提高100倍。该检测体系能从人工接种和自然发病的花生和玉米样品中扩增到211bp的特异片段,实现对黄曲霉菌的快速可靠检测。

摘要：利用细菌16S-23S r DNA内源转录间隔区通用引物L1/L2扩增烟草青枯病菌基因组DNA,并对其扩增产物进行克隆测序,经与近缘种序列多重比对分析后,设计1对特异性引物Rs F/Rs R,用于包括烟草青枯病菌在内的15种不同细菌、5种真菌、3种卵菌基因组DNA的PCR扩增。结果表明:在优化的反应体系与程序条件下,该对引物只能从烟草青枯病菌中扩增出241 bp的特异片段,并通过序列测定验证了其准确性;将引物Rs F/Rs R与细菌通用引物L1/L2进行巢式PCR扩增后,其检测灵敏度在DNA水平上可达0.4 fg/μL,较常规PCR提高1 000倍,表明该对引物能有效地用于烟草组织及土壤中青枯病菌的检测。此结果对烟草青枯病的早期诊断、快速检测及病害流行学研究具有重要意义。

摘要：黄曲霉Aspergillus flavus是一种广泛存在的致病真菌,早期准确检测黄曲霉并加以控制是减少黄曲霉毒素产生的有效措施。本研究利用真菌通用引物ITS1/ITS4扩增黄曲霉转录间隔区并进行克隆测序,通过序列比对,设计1对黄曲霉特异性引物S1/X2,由此建立的PCR检测体系对包括黄曲霉在内的5种曲霉菌及其他17种不同的真菌、细菌基因组DNA进行扩增,结果只有不同来源的黄曲霉菌株能扩增出334bp的特异性条带,而其余参试菌株均无扩增产物,其检测灵敏度在DNA水平上可达到280fg。该检测体系能从自然发病的花生或玉米组织中扩增到334bp的特异片段,实现对黄曲霉的快速可靠检测。