摘要：定向进化技术是一种有效的蛋白质改造手段,能够对结构功能不明确的蛋白质进行改造,主要包括突变文库构建与高通量筛选两部分。定向进化除了能够对蛋白质的已有性状进行优化,也能在特定环境下开发出自然界中不存在的特性,这是定点突变等其他改造手段所难以做到的。本文对定向进化在蛋白质改造中的应用发展进行概述,以期为定向进化在改善医药、工业领域中蛋白质的应用提供依据。

摘要：【背景】粗糙链霉菌(Streptomyces scabrisporus)HBERC-53204是本中心自主分离的一株链霉菌,经鉴定,其产生一种活性化合物司替霉素B(steffimycin B,SMB),对多种动植物重要病原菌具有良好生物活性。【目的】提高SMB发酵水平,拓宽放线菌活性天然产物在农牧业领域的研究及应用。【方法】以本实验室筛选出的一株产SMB的粗糙链霉菌HBERC-53204为研究对象,运用单因素试验筛选培养基的主效碳源、氮源、无机盐及各营养成分最适浓度,并基于单因素试验结果,通过Plackett-Burman(PB)试验设计筛选出显著影响因素,再结合最陡爬坡试验、Box-Behnken(BB)响应面法拟合显著因子与产量的非线性方程求解,进一步优化菌株产SMB的最佳发酵培养基配方。【结果】优化后最佳培养基配方为:葡萄糖36.22 g/L,蛋白胨8.00 g/L,酵母粉8.51 g/L,酸水解酪蛋白1.50 g/L,MgSO_(4) 0.68 g/L,KNO_(3) 1.00 g/L。经摇瓶验证,优化后SMB效价达到477.26 mg/L,比初始配方产量提高1773.08%。在20 L发酵罐培养120 h,目标化合物产量达到214.48 mg/L。【结论】通过对菌株HBERC-53204发酵培养基优化,显著提高了SMB产量,并在20 L发酵罐中得到验证,在此基础上获得了克级纯品。

摘要：为了提高P277肽抗1型糖尿病的作用,把P277肽融合在卡介苗热休克蛋白65的C端,构建了pET28a- HSP65-P277高效表达载体,在大肠杆菌中高效可溶性表达。利用硫酸铵分级沉淀、阴离子交换柱层析分离纯化了融合蛋白HSP65-P277。使用HSP65-P277在没有任何佐剂存在的情况下免疫非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠,通过三次腹腔注射,每月收集被免疫动物的血清,血糖浓度用自动生化分析仪测定。结果显示HSP65-P277免疫组小鼠血糖平均值及糖尿病的累积发病率和其余组相比均有显著差异(P<0.01),融合蛋白HSP65-P277抗NOD小鼠糖尿病的作用显著高于单独的P277和HSP65。为进一步开发能用于临床的1型糖尿病疫苗提供了良好的设计思路,HSP65-P277极有可能进一步发展成为新的抗Ⅰ型糖尿病的疫苗。

摘要：目的:合成、克隆及融合表达N端延伸2个Pro,并由Gly取代N端第2个氨基酸Ala的人肠生长激素类似物PP-h[Gly2]GLP-2,初步测定其促肠生长的生物学活性。方法:合成长度分别为53,54及53个碱基的三段寡核苷酸,以中段寡核苷酸为模板,两端寡核苷酸为引物,经PCR合成PP-h[Gly2]GLP-2基因,克隆于pUC18载体。经测序正确后,将该基因与融合表达载体pED连接构建融合表达质粒pEDGLP-2,转化***21(DE3),进行诱导表达,用SDS-PAGE分析。融合蛋白经分离纯化和酸切割后,分离获得PP-h[Gly2]GLP-2,用电喷雾质谱法测定其相对分子质量,并对雄性SD大鼠皮下给药14 d,初步测定其促肠生长活性。结果:诱导后融合蛋白表达量占菌体可溶性总蛋白的40%以上。电喷雾质谱法测得:经酸切割获得的PP-h[Gly2]GLP-2的相对分子质量为3 947.97 Da,与预测值3 947.38 Da基本一致。初步动物实验结果显示,0.5 mg/(kg.d)剂量组小肠增重百分比为41.65%,与PBS组相比具有显著差异。结论:制备获得的人肠生长激素类似物PP-h[Gly2]GLP-2,与设计的相对分子质量一致,有明显的促肠生长活性。

摘要：选取了HSP65上对自身免疫性炎症疾病有防治作用的两段功能表位P1(179-190)、P2(31-46),分别以HSP65和CTB为载体蛋白构建高效表达载体pET28a-HSP65-P1P2P1与pET28a-CTB-P1P2P1,以硫酸铵分级沉淀和包涵体洗涤、经DEAE阴离子交换柱层析分离纯化得到HSP65-P1P2P1与CTB-P1P2P1融合蛋白,并用戊二醛一步偶联法将两者偶联形成HpCp复合物。以小剂量滴鼻粘膜免疫高胆固醇膳食诱发产生动脉粥样硬化的新西兰大白兔,结果显示两组融合蛋白均表现出一定的减斑功效,与PBS对照组相比较,主动脉病斑面积分别减少了34.9%和27.9%,为进一步开发能用于临床的抗AS疫苗提供了良好的设计思路,可经进一步优化设计提高其免疫原性,研发为抗动脉粥样硬化疫苗。

摘要：利用大肠杆菌表达系统,表达猪源羧肽酶原B蛋白包涵体,并对包涵体的体外复性条件进行优化。对猪源羧肽酶原B基因进行设计,优化稀有密码子,并将基因片段插入到pET28a载体中,构建表达质粒pET28a-proCPB,并转化入BL21(DE3)中。通过乳糖诱导表达得到包涵体。通过检测酶的比活力来考查复性液的pH、蛋白终浓度、氧化还原对比例、复性时间、复性温度对复性程度的影响。最终确定的体外稀释复性条件为:复性液成份为100mmol/L Gly-NaOH、pH=9.5、GSH与GSSG的比例为1∶0.8(GSH为1mmol/L)、蛋白终浓度为200μg/ml、复性温度为25℃、复性时间24h。通过检测,复性液中酶的比活力为11.7u/mg,经过DEAE纯化后酶的比活力可达到73u/mg。

摘要：从免疫学的角度出发,设计一种以血管紧张素Ⅱ为功能表位的DNA疫苗,考察其药效及安全性,并试图阐释其作用机制。抗高血压核酸疫苗以6段血管紧张素Ⅱ为核心,乙型肝炎病毒核心蛋白(HBc)为免疫载体,为克服自体的免疫耐受,又以白介素Ⅳ作为佐剂。肌肉注射肾性高血压模型大鼠,考察该疫苗的免疫原性及药效。结果:试验表明肌肉注射该疫苗能诱导机体产生持续8周的高滴度特异性抗体,有效降低血液中的血管紧张素Ⅱ含量,同时降低模型大鼠的收缩压20 mmHg,降低舒张压9 mmHg。此外,组织病理学检查表明,该核酸疫苗能明显抑制心肌纤维化的发展,有效逆转心肌肥厚。结论:血管紧张素Ⅱ作为高血压的有效靶标,可通过疫苗免疫途径进行阻断。该研究为高血压疫苗的研究提供了一种新的思路,具有较好的应用前景。

摘要：基于创新探索思维,在生物制药综合实验课程的改革中,教学团队尝试增加探究性、设计性、创新性实验项目,融入思政元素,完善混合式教学方法,健全多元化课程评价机制,形成与生命科学和药学事业发展相适应的核心实验教学体系,助力一流生物制药专业人才的培养。

摘要：以人绒毛膜促性腺激素β亚基（βhCG）的羧基端109~118的6段串联重复表位为靶点、热休克蛋白65（HSP65）为载体,设计一种新型的蛋白疫苗HSP65-X6-βhCGCTP37,探讨其能否抑制小鼠前列腺癌,并且对其抗肿瘤的作用机理进行部分探讨。以制备的HSP65-X6-βhCGCTP37免疫C57BL/6小鼠,分别检测体液免疫应答和细胞免疫应答。通过ELISA法,从血清中检测到高滴度的抗βhCGIgG类抗体。Western blot实验证明小鼠血清中的抗体能够特异性识别βhCG表位。淋巴细胞增殖实验的结果显示,HSP65-X6-βhCGCTP37的免疫能够有效的刺激脾淋巴细胞的增殖。预防性实验的结果显示,HSP65-X6-βhCGCTP37激发的免疫应答对于RM-1肿瘤攻击起到有效的保护作用,与PBS阴性对照组比较,平均肿瘤重显著降低（P〈0.05）。同时有效地减少了小鼠的肺转移（P〈0.01）;抑制了小鼠皮内肿瘤模型中的血管新生（P〈0.01）。HSP65-X6-βhCGCTP37蛋白疫苗能有效地抑制小鼠前列腺癌的生长。

摘要：目的研究热休克蛋白65 B细胞表位经皮下免疫高脂膳食动物对动脉粥样硬化(As)斑块生成的影响。方法利用HSP65上与炎症性自身免疫性疾病相关的两段功能表位P1(179-190)、P2(31-46),以CTB为载体蛋白构建高效表达载体p ET28a-CTB-p117,提取纯化获得可用于动物实验的蛋白,皮下免疫新西兰大白兔,比较抗HSP65抗体、血液总胆固醇含量变化与主动脉粥样硬化斑块的生成情况。结果能够诱导产生抗HSP65的抗体,血液中总胆固醇含量与对照组比较显著提高,并且能显著增加主动脉As斑块生成(P<0.05)。结论 HSP65相关表位蛋白以CTB为载体蛋白,在弗氏不完全佐剂条件下,经皮下免疫能显著加重As斑块生成,分析是因为抗HSP65抗体生成,促进炎症反应,脂类代谢变化进而促进As斑块的形成。可基于此,利用以上表位,改变免疫方式,设计出可用于降低斑块生成的抑制As斑块生成的免疫调节剂。对于CTB单独皮下免疫也致As斑块加重的结果需进一步实验考察验证。