摘要：目的建立一种简便、快速、灵敏、特异的分支杆菌菌种鉴定方法。方法通过 1 6SrDNA聚合酶链反应 单链构象多态性 (polymerasechainreaction singlestrandedconformationpolymorphism ,PCR SSCP)分析鉴定 1 4 0株分支杆菌临床分离株 ;设计与合成用于鉴定分支杆菌菌种的 1 6SrDNA寡核苷酸探针 ,制作膜芯片 ,与待测菌株生物素标记的 1 6SrDNA基因PCR产物进行反向斑点杂交。结果 1 4 0株分支杆菌临床分离株中 ,经 1 6SrDNAPCR SSCP初步鉴定 ,1 33株为结核分支杆菌复合群 ,7株为非结核分支杆菌。经膜芯片杂交分析 ,1 33株结核分支杆菌分离株鉴定为结核分支杆菌复合群 ;7株非结核分支杆菌中 ,1株鉴定为戈登分支杆菌 ,1株为土分支杆菌 ,1株为偶发分支杆菌 ,1株为胞内分支杆菌 ,另 3株与分析探针杂交阴性。分析 2 8种分支杆菌标准菌株和 9种非分支杆菌菌株 ,结果显示寡核苷酸探针是特异的。结论 1 6SrDNAPCR 膜芯片技术灵敏度高、特异性强、简便、快速 。

摘要：目的研制一种新型DNA芯片,用于快速检测结核分枝杆菌耐异烟肼katG基因突变。方法根据结核分枝杆菌katG基因序列设计探针并制作DNA芯片,用四甲基罗丹明标记的引物扩增结核分枝杆菌katG基因突变热点的片断,与DNA芯片杂交,同时以聚合酶链反应-单链构象多态性(pdymerase chain reaction-single stranded conformation polymorphism,PCR-SSCP)和DNA测序法为对照。结果153株结核分枝杆菌临床分离株中30株异烟肼敏感株的PCR-SSCP和DNA芯片杂交结果与结核分枝杆菌标准株完全相同,123株异烟肼耐药株中有85株检测到katG基因突变,占69.1%(85/123)。其中83株为315位密码子AGC→ACC突变,2株为315位密码子AGC→AAC突变,该突变与PCR-SSCP和DNA芯片杂交结果一致;余38株未检测到突变,经测序证实其中1株PCR-SSCP有不同突变的为279位密码子GGC→GAC突变,因芯片上未点该位点的探针,所以杂交结果为阴性。结论用DNA芯片可快速、特异地检测出大多数结核分枝杆菌耐异烟肼分离株的katG基因突变,可用于临床耐药性的检测,指导临床用药。

摘要：目的应用寡核苷酸探针膜杂交法快速检测临床分离株中结核分枝杆菌对异烟肼(INH)、链霉素(SM)、乙胺丁醇(EMB)的耐药性。方法设计与合成用于检测结核分枝杆菌3种药物常见耐药基因的寡核苷酸探针,点于硝酸纤维素膜上,与结核分枝杆菌临床分离株生物素标记的聚合酶链反应(PCR)产物进行反向斑点杂交。结果26株耐INH菌株中,16株Klb杂交阳性;7株inhla杂交阳性;23株耐SM菌株中,17株rpsl基因突变型探针Slb杂交阳性,2株突变型探针rrslb杂交阳性;31株耐EMB菌株中,13株Elb杂交阳性,1株Elc杂交阳性,5株Eld杂交阳性,1株Ele杂交阳性,11株与El探针杂交。kagG、inhA、rp-sL、rrs和embB基因膜杂交突变检出率分别为61.5%,26.9%,74%,8.7%和64.5%,与PCR-DS分析结果一致。结论寡核苷酸探针膜杂交技术可能成为检测部分结核分枝杆菌耐药基因型简便、快速的方法。

摘要：目的研制一种新型DNA芯片,用于快速检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因突变。方法根据结核分枝杆菌rpoB基因序列设计探针并制作DNA芯片,用TAMRA标记的引物扩增结核分枝杆菌rpoB基因突变热点的片断,与DNA芯片杂交,同时以PCR-SSCP和DNA测序法为对照。结果240株结核分枝杆菌临床分离株中,55株全敏感株和66株耐其他药物的利福平敏感株的PCR-SSCP和DNA芯片杂交结果与结核分枝杆菌标准株完全相同;119株耐RFP临床分离株中DNA芯片杂交有117株检测到rpoB基因突变,其中111株单位点突变,78株为531位密码子TCG→TTG(Ser→Leu)、TCG→TGG(Ser→Trp)和TCG→TAC(Ser→Tyr)突变;24株为526位密码子CAC→TAC(His→Tyr)、CAC→GAC(His→Asp)、CAC→CCC(His→Pro)、CAC→CTC(His→Leu)和CAC→CGC(His→Arg)突变;4株为516位密码子GAC→GTC(Asp→Val)和GAC→GGC(Asp→Gly)突变;3株为533位密码子CTG→CCG(Leu→Pro)突变;1株为511位密码子CTG→CCG(Leu→Pro)突变;1株为513位密码子CAA→AAA(Gln→Lys)突变;6株为双位点突变,其中3株511和516位联合突变,2株533和515位联合突变,1株517位密码子CAG→CAC(Gln→His)和518位密码子AAC→GAC(Asn→Asp)联合突变。DNA测序结果与DNA芯片杂交结果完全一致。1株516位GAC-TAC(Asp→Tyr)突变的分离株及1株516位GAC-TAC(Asp→Tyr)和518位AAC-CAC(Asn→His)联合突变的分离株DNA芯片检测阴性,是因为芯片上无相应的探针。结论用DNA芯片可快速、特异地检测出大多数结核分枝杆菌耐利福平分离株的rpoB基因突变,可用于临床耐药性的检测,指导临床用药。

摘要：目的　应用膜反向斑点杂交技术快速检测结核分枝杆菌对链霉素 (SM)的耐药性。方法　设计与合成用于检测结核分枝杆菌耐SM基因rpsL和rrs的寡核苷酸探针 ,点于硝酸纤维素膜上 ,与结核分枝杆菌分离株生物素标记的聚合酶链反应(PCR)产物进行反向斑点杂交 ,并与PCR -单链构象多态性 (PCR -SSCP)和PCR -直接测序 (PCR -DS)结果比较。结果　 5 3株结核分枝杆菌临床分离株中 ,三种检测方法符合率为 10 0 %。 9株敏感株rpsL和rrs基因的SSCP图谱、膜杂交结果与标准株完全相同 ;44株耐SM菌株中 ,3 3株存在rpsL基因 43位密码子AAG→AGG突变 ,6株有rrs基因 5 13位A→C突变 ,1株有rrs基因 5 13位A→T突变 ,突变检出率为 90 .9%,40株耐SM菌株和 9株敏感株可用膜杂交方法检测出来 ,与传统药敏试验方法检测符合率为 49/5 3。结论　应用膜反向斑点杂交技术检测结核分枝杆菌耐SM基因型灵敏度高、特异性好、简便、快速 。

摘要：目的应用寡核苷酸探针膜反向斑点杂交技术快速检测结核分支杆菌对异烟肼(isoniazid,INH)耐药性。方法设计与合成用于检测结核分支杆菌耐INH基因katGi、nhA的寡核苷酸探针,点于硝酸纤维素膜上,与结核分支杆菌临床分离株生物素标记的聚合酶链反应(PCR)产物进行反向斑点杂交,并与PCR-单链构象多态性(Polymerase chain reaction-Single stranded conformation polymorphism,PCR-SSCP)和PCR-直接测序(PCR-directsequencing,PCR-DS)结果比较。结果20株INH敏感株中,仅9株出现野生型探针K1阳性杂交,余11株中,10株K1b'杂交阳性,PCR-DS显示katG基因315位密码子AGC→ACC,1株K1c'杂交阳性,PCR-DS显示katG基因315位密码子AGC→AAC;15株出现野生型探针inh1阳性杂交,另5株Inha1探针杂交阳性,PCR-DS显示inhA基因-15位C→T突变。36株耐药株中,17株K1探针杂交阳性,18株K1b'杂交阳性,1株与所试探针不杂交,PCR-DS显示katG基因279位密码子GGC→GAC;11株与突变型Inha1探针阳性杂交,25株与野生型探针inh1杂交阳性。katG基因膜杂交突变检出率为50%,inhA基因膜杂交突变检出率为30.56%。结论寡核苷酸探针膜杂交技术可能成为检测部分结核分支杆菌耐异烟肼基因型简便、快速的方法。

摘要：目的研制一种新型DNA芯片,用于快速检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因突变。方法根据结核分枝杆菌rpoB基因序列设计探针并制作DNA芯片,PCR掺入法荧光标记根据结核分枝杆菌rpoB基因突变热点的目的片断,与DNA芯片杂交,同时以DNA测序法为对照。结果18株结核分枝杆菌临床分离株中,1株敏感株DNA芯片杂交结果与标准株完全相同;17株耐RFP临床分离株中有17株检测到rpoB基因突变,其中14株单位点突变,1株511和516位双位点突变,与测序结果完全一致。另有两株为517和518、526和517位双位点突变,因为芯片上未点517位突变的探针,所以只检测到518和526位的突变,该突变与测序结果完全一致。结论用DNA芯片可快速、特异地检测出大多数结核分枝杆菌耐利福平分离株的rpoB基因突变,可用于临床耐药性的检测,指导临床用药。