摘要：建立线粒体抗病毒蛋白(mitochondrial antiviral-signaling protein,MAVS)全长及截短体的真核表达载体,并检测其在HEK293细胞中的表达,为后续探索MAVS在病毒逃逸机制研究中的作用提供重要的实验材料。首先,根据NCBI数据库中人源MAVS的全长序列,设计截短体引物,通过PCR从cDNA模板中扩增出MAVS全长及不同截短体的基因片段,并将其克隆到pcDNA3.1-3xflag载体中。随后,将构建好的载体转染到HEK-293细胞中,利用RT-PCR技术检测扩增产物大小,与目的大小进行对比,用Western blot技术检测MAVS蛋白在293细胞中的表达情况。结果表明,成功构建了全长MAVS(MAVS-FL)及其截短体MAVS-△C、MAVS-△CP、MAVS-PBD、MAVS-△Tm的真核表达载体,Western blot结果表明,构建的载体蛋白在HEK-293中能够有效表达。本研究成功构建了MAVS全长及其截短体的真核表达载体,并在HEK-293细胞中表达了这些蛋白,为后续研究MAVS蛋白的功能和抗病毒机制提供了实验材料。

摘要：为构建脑心肌炎病毒VP2 2A基因真核表达载体。参考EMCV毒株基因组序列,设计VP2 2A基因特异性引物,PCR扩增VP22A基因目的片段,双酶切目的基因和pc DNA3.1-Flag质粒产生相同的黏性末端,使用T4 DNA连接酶连接相同的黏性末端,连接产物转化至DH5α感受态细胞,菌液PCR鉴定阳性单克隆菌落,对阳性单克隆提取重组质粒并双酶切进行验证,对阳性重组质粒进行测序。重组质粒双酶切和测序结果表明,pc DNA3.1-Flag-VP2和pc DNA3.1-Flag-2A真核表达载体构建成功。

摘要：旨在建立快速特异的牛轮状病毒(BRV)实时荧光定量PCR检测方法,用于病原初步筛查。首先以BRV VP4作为目的基因,通过查询Genbank设计合成引物,然后将扩增的VP4基因片段克隆至pMD 18-T载体中,构建重组质粒标准品,最后经优化反应条件,建立了最低检测量可达7.21 copies/μl的EvaGreen荧光定量检测方法。经验证,该方法特异性好,对牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒、猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒及牛结核分枝杆菌的检测结果均为阴性;重复性较强,组内重复和组间重复变异系数分别为0.95%~1.12%和1.55%~2.18%。此外,利用该方法检测了21份ELISA阳性样本,测得阳性符合率为90.47%。本研究建立的BVR VP4 RT-qPCR检测方法特异、敏感、可重复,可用于病原的快速检测,为BRV临床诊断提供了一种高效、可靠的检测方法。

摘要：背景:现已证实,人肌腱、牛肌腱、鼠尾、猪皮、新生牛跟腱制备的胶原蛋白海绵有良好的细胞相容性。目的:采用新生牛皮提取胶原蛋白、制备生物医用胶原蛋白海绵,观察其与羔羊肾成纤维细胞的相容性。设计、时间及地点:对比观察实验,于2006-05/2007-02在西北民族大学生命科学与工程学院生物工程与技术国家民委重点实验室完成。材料:出生24h内宰杀的新生尕里巴牛犊皮,岷县黑裘皮羔羊肾原代成纤维细胞。方法:取新生牛犊皮,经脱毛、胃蛋白酶+冰醋酸联合处理、盐析、透析、冻干后制备胶原蛋白海绵。将海绵与羔羊肾F3代成纤维细胞混悬液共培养,分别设胶原海绵材料组、阴性对照组(生理盐水)、阳性对照组(橡胶塞浸提液)。主要观察指标:应用倒置相差显微镜及JVC数码摄像系统观察、拍摄与记录细胞形态、生长情况。培养20,35d,对共培养物进行AO染色,观察细胞在胶原海绵中的增殖情况。培养65d后制石蜡切片,行苏木精-伊红染色,观察细胞在胶原海绵中的生长情况。结果:阳性对照组细胞培养24h细胞圆缩,不贴壁,3d后全部死亡。胶原海绵材料组与阴性对照组细胞形态均正常,细胞贴壁生长良好。随着培养时间的延长,海绵孔隙逐渐变小,细胞数量增加,形态变小,海绵外观从柔软、混浊变得挺拔、透明。AO染色显示培养20,35d的胶原海绵-羔羊肾成纤维细胞共培养物中有大量细胞存在,并且在胶原蛋白空隙中有大量细胞成团簇状生长。苏木精-伊红染色显示有大量蓝色细胞核和新生的红色胶原纤维。结论:制备的新生牛皮胶原蛋白海绵对岷县黑裘皮羔羊肾成纤维细胞有良好的相容性。

摘要：为建立一种快速检测跨膜蛋白39A(TMEM39A)基因的方法,根据GenBank中登录的不同种属TMEM39A基因序列的保守区域,设计并合成1对荧光定量通用性引物,经过条件优化,建立了检测TMEM39A基因的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。结果显示:标准品模板在3. 937×10~8～3. 937×10~3拷贝·μL^(-1)范围内呈良好的线性关系,R^2可达0. 999;该方法特异性较好,检测灵敏度可达3. 937×10~2拷贝·μL^(-1);组内和组间变异系数均小于1%,具有较高的重复性和稳定性;利用该方法能够检测出不同细胞中的TMEM39A含量,具有种属通用性。该研究方法的建立为临床上提供了一种TMEM39A的快速检测和定量分析技术。

摘要：为制备小反刍兽疫病毒(PPRV)非结构蛋白C单克隆抗体,根据PPRV C基因编码多肽链氨基酸序列抗原性分析,设计合成一条含20个氨基酸的抗原肽(CRSGKPRGETPGPLLPEIMQ)和一条含21个氨基酸的筛选抗原多肽(PLRAGERGLAPQAVQHRTLIK),将它们分别与钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin, KLH)和生物素羧基蛋白(biotin carboxyl carrier protein, Biotin)交联,制备获得免疫原和筛选抗原。用免疫原肌肉注射5只8~12周龄、体重约20 g的无特定病原体(specific pathogen free, SPF)级BALB/c雌性小鼠,第1次免疫后分别间隔7 d进行第2次免疫和第3次免疫,三免后21 d进行冲击免疫,冲击免疫后第3天采集血液分离血清,采用间接酶联免疫吸附法(ELISA)测得1只免疫小鼠血清抗体效价为1∶312 500,2只为1∶62 500。取3只小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0经聚乙二醇(PEG)融合制备杂交瘤细胞,通过间接ELISA筛选出26株阳性淋巴杂交瘤细胞,进一步经克隆化培养筛选出46株单克隆细胞株。通过Western blot(WB)筛选获得2株能稳定分泌特异性抗PPRV C蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,WB、间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay, IFA)鉴定显示,制备的单克隆抗体具有较好的灵敏性和病毒反应性。研究结果为进一步阐明C蛋白在PPRV生命周期中的作用奠定了基础,也为小反刍兽疫(PPR)诊断提供了有效的诊断试剂。

摘要：为建立一种CD63基因TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,以期为CD63基因的动态检测提供有效的实验手段,根据GenBank中公布的CD63基因序列,设计1对荧光定量PCR引物及1条探针,建立一种快速检测CD63基因的实时荧光定量PCR方法,并对建立的方法进行条件优化。结果显示,建立的实时荧光定量PCR方法线性关系较好,以质粒标准品构建的标准曲线相关系数r2为0.997;灵敏性及重复性均较高;应用建立的方法对多种种属来源细胞进行检测,能检出不同类型细胞中CD63的含量。结果表明,成功建立了一种快速、准确检测CD63基因的TaqMan实时荧光定量PCR方法。

摘要：三基序蛋白21(TRIM21)与癌症、肿瘤及固有免疫等密切相关。为了快速检测TRIM21基因的表达,根据Genbank中公布的TRIM21基因序列设计引物,通过常规PCR扩增该基因后克隆至pMD-18T载体上,测序并鉴定正确后制备重组质粒,以pMD-18T-TRIM21重组质粒作为标准品进行荧光定量PCR并建立标准曲线。采用重复性、特异性及灵敏性等试验,成功建立了检测TRIM21基因的荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法灵敏度高,最低检测下限为37.7 copies·μL^-1,比普通PCR高出10倍。在3次独立的试验中,组内和组间变异系数较小,具有较高的可重复性,同时,还能检出不同细胞中TRIM21的表达。因此,该荧光定量方法可为TRIM21的检测及临床研究提供技术支持。