摘要：地衣芽孢杆菌是具有广泛应用的重要工业微生物,迄今为止这一菌株的基因编辑工具仍十分有限。CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9系统已在许多物种中成功应用于基因编辑,然而地衣芽孢杆菌极低的转化和重组效率为CRISPR/Cas9系统在这一宿主中的应用带来障碍。本研究构建了诱导型表达Cas9蛋白的重组质粒,成功实现了CRISPR/Cas9系统介导的地衣芽孢杆菌淀粉酶编码基因amy L的敲除。结果显示,所设计的3个sg RNA均能实现目的基因的有效编辑,基因敲除的成功率分别为58%、39%和37%。淀粉酶基因敲除的重组大肠杆菌生长无显著影响,淀粉酶活力为原始菌的0.86%。以上成果为研究地衣芽孢杆菌的基因功能及通过菌种改造提升这一工业微生物的发酵性能提供了新型、有效的基因编辑工具。

摘要：【目的】实现鼠灰链霉菌来源经密码子优化后的腺苷酸脱氨酶基因在乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis GG799)中组成型表达。【方法】以鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)来源的腺苷酸脱氨酶(AMP)基因经密码子优化后作为模板,设计特异性引物,PCR扩增AMP脱氨酶基因opt-AMPD,以p KLAC1为载体构建重组表达质粒p KLAC1-opt-AMPD,经Sac II线性化后电转化法转入*** GG799,筛选得到重组菌株,测定酶活,经His TrapTM HP纯化后得到AMP脱氨酶,并优化重组菌的发酵培养基。【结果】对AMP脱氨酶基因进行了密码子优化后,构建了重组*** GG799/p KLAC1-opt-AMPD,实现组成型表达,密码子优化后AMP脱氨酶酶活提高到586±50 U/m L。SDS-PAGE结果显示,纯化后的AMP脱氨酶为单一条带,蛋白大小约为60 k D。优化的发酵培养基为(g/L):葡萄糖40、蛋白胨20、酵母粉15、Na Cl 8、KCl 10、Mg SO4 2,30°C、200 r/min发酵120 h,酶活达到2 100±60 U/m L。【结论】实现了密码子优化后的腺苷酸脱氨酶基因在乳酸克鲁维酵母GG799内的组成型表达,为实现腺苷酸脱氨酶的重组高效表达和发酵生产进行了有益探索。

摘要：番茄红素作为一种高附加价值的萜类化合物已受到国内外研究者的广泛关注。首先对酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae模式菌株S288c和YPH499合成番茄红素的能力进行分析比较,结果表明YPH499更适合作为底盘细胞用于番茄红素的合成。随后比较组成型启动子GPDpr、TEF1pr和诱导型启动子GAL1pr、GAL10pr对番茄红素合成的影响,结果发现以GPDpr、TEF1pr作为番茄红素合成途径基因crtE、crt B和crtI的启动子,摇瓶发酵60 h后,番茄红素产量为15.31 mg/L;以GAL1pr和GAL10pr为启动子时,其产量为123.89 mg/L,提高8.09倍。继续改造甲羟戊酸(MVA)途径,过量表达N-末端截短的关键酶基因t HMG1(3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶),番茄红素产量为265.68 mg/L,单位菌体产量72.79 mg/g。文中所设计构建的异源表达番茄红素合成途径的酿酒酵母菌株单位细胞产量高,可以进一步改造和优化后用于番茄红素的工业化生产。

摘要：目的:利用基因重组技术,构建腺苷酸脱氨酶高效表达的重组菌株。方法:以前期构建的产腺苷酸脱氨酶重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28α-AMPD中来源于鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)目的基因为模板,设计特异性引物扩增腺苷酸脱氨酶基因,亚克隆至游离型表达载体pHY-WZX,转化枯草芽孢杆菌WB600。结果:成功筛选获得了一株产腺苷酸脱氨酶重组枯草芽孢杆菌WB600/pHY-AMPD,进一步在摇瓶中探究了发酵培养基成分对重组酶发酵的影响。获得了较优发酵培养基为:葡萄糖10 g/L、?酵母膏30 g/L、CaCl2 0.5 g/L、柠檬酸三钠1 g/L、NaH2PO4 10 g/L、K2HPO4 10 g/L、(NH4)2SO4 5 g/L,37℃、200 r/min发酵60 h摇瓶发酵液酶活力可达到(2 230±50)U/m L。结论:本研究实现了鼠灰链霉菌来源的腺苷酸脱氨酶基因在枯草芽孢杆菌中表达。