摘要：目的:设计构建抗PDL1-CAR慢病毒载体,分析嵌合抗原受体T(chimeric antigen recptor T, CART)细胞的结构和功能,同时优化CART细胞的转染和培养,增加CART细胞的表达率和杀伤活性。方法:构建靶向程序性死亡配体1(programmed death-ligand1,PDL1)的CAR慢病毒载体,按病毒感染复数(multiplicity of infection, MOI)=10、20、40的条件进行转染,采用非磁珠法进行培养扩增,荧光显微镜和流式细胞仪检测转染后CART细胞的表达,最后采用流式绝对计数法检测CART细胞的杀伤性。结果:采用GV401质粒构建的抗PDL1-CAR慢病毒载体,经培养扩增后3组MOI的CART细胞阳性表达率分别为28.80%±0.46%、54.77%±0.32%、71.37%±0.42%,并在荧光显微镜下观察到抗PDL1-CAR细胞表达绿色荧光。在效靶比为2:1、5:1和10:1时,抗PDL1-CAR细胞比T细胞对PDL1-CA46细胞的杀伤率更高(Z=-1.964, P <0.05)。结论:构建抗PDL1-CAR慢病毒载体,可以为其他各种CART细胞的构建提供良好参考,CART细胞的表达率和杀伤活性的提高,为CART细胞的功能研究奠定基础。

摘要：目的:探索稳定下调钙网蛋白(calreticulin,CALR)对NK/T细胞淋巴瘤细胞SNK6细胞侵袭性的影响及其可能机制。方法:设计靶向人钙网蛋白的特异性短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)序列,构建重组慢病毒载体;三质粒系统包装慢病毒颗粒,感染SNK6细胞,嘌呤霉素抗性筛选稳定下调钙网蛋白表白的SNK6细胞。应用CCK8法测定细胞增殖活力,Transwell小室测定细胞侵袭。Western blot检测SNK6细胞CALR表达水平,荧光定量PCR检测SNK6细胞CALR、MMP2、MMP9和VEGF的转录水平。结果:成功构建重组慢病毒载体pLKO.1-puro-shCALR,并包装慢病毒,筛选出稳定下调钙网蛋白的SNK6细胞株。稳定下调SNK6细胞钙网蛋白表达后,SNK6侵袭性减弱,MMP2、MMP9和VEGF的转录水平降低。结论:稳定下调SNK6细胞钙网蛋白的表达可使SNK6细胞侵袭性减弱,其机制可能与降低MMP2、MMP9和VEGF的转录水平有关。

摘要：目的构建人GM-CSF基因的重组腺病毒载体,探讨其在树突状细胞(DC)中的表达。方法设计一对GM-CSF基因上下游引物,以质粒pBlu-hGM-CSF为模板,经PCR扩增获得GM-CSF基因全部序列。片段回收后经酶切,定向插入腺病毒穿梭质粒,获得重组质粒pshuttle-CMV-GM-CSF。经双酶切、PCR及插入片段测序鉴定后,将正确重组体转化包含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183菌。同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆,提取质粒,将2种重组腺病毒质粒分别进行酶切、线性化、纯化,用脂质体转染293细胞。制备病毒上清并测定其滴度,并感染人树突状细胞。结果完成构建含有人GM-CSF基因的重组腺病毒,病毒滴度Ad-GM-CSF 5.2×109pfu/mL。RT-PCR及ELISA检测证实GM-CSF在DC中表达。结论构建重组腺病毒载体,并在DC表达GM-CSF抗原蛋白。