摘要：目的　用随机PCR技术制备构建靶基因文库的随机基因片段。方法　先扩出靶基因 (HIV1Envgp160 )片段 ,然后设计两条引物 ,1条为锚定随机引物用于扩出靶基因的随机片段 ,另 1条为锚定特异引物用于对随机片段进行扩增 ,得到大量的随机片段 ;优化模板量、dNTP浓度、反应时间、温度和DNA聚合酶等反应条件 ,扩出靶基因的随机片段。结果　得到用于建库的理想靶基因随机片段。结论　随机PCR是制备靶基因文库随机片段的一个简便有效方法。

摘要：以杆状病毒 -昆虫细胞表达系统Bac-to -Bac为模型 ,就目前存在较多争论的HCV核心蛋白的加工和细胞定位问题进行探讨。根据核心蛋白的亲水性分析结果 ,设计了三种长度的基因片段 (C173 、C191和C2 15) ,经过PCR扩增、重组转移载体构建、细菌内转座和昆虫细胞转染 ,获得三种重组病毒 (rvBACC173 、rvBACC191和rvBACC2 15)用于表达分析。SDS -PAGE电泳和免疫印迹试验表明 ,昆虫细胞能够识别核心蛋白第 191和 192位氨基酸之间的切点并低效率切割 ;但不能够识别 173～ 191位之间的切点。间接免疫荧光试验表明 ,截断型核心蛋白C173 定位于细胞核内 ,而C191和C2 15则停留在细胞浆中。rvBACC173 感染的细胞在核内出现单一的“类晶体样结构” ,电子显微镜分析证实 ,这种结构是截断型核心蛋白大量转运并沉积在细胞核内形成的蛋白聚合体。试验结果还表明 ,第 173至 191之间的疏水性序列负性调节蛋白的表达 ,并且影响蛋白在细胞内的分布。间接ELISA实验证实 。

摘要：根据丙型肝炎病毒 (HCV)丝氨酸蛋白酶晶体结构特点 ,设计并构建了一种新的单链型丝氨酸蛋白酶分子 .该分子由辅因子NS4A的核心序列、柔性连接子GSGS和NS3丝氨酸蛋白酶结构域组成 .利用设计的 3条引物 ,通过 2轮PCR获得单链丝氨酸蛋白酶基因 ,插入原核表达载体pQE30中 ,转化大肠杆菌M15 ,获得重组克隆 .经低剂量诱导和低温培养 ,目的基因获得高水平可溶表达 .以金属螯合层析法纯化的重组蛋白纯度达 95 %以上 .间接ELISA法检测 98份血清证实 ,该蛋白具有良好的抗原性和特异性 ;以重组蛋白底物NS5ab和单链丝氨酸蛋白酶建立了简便、实用的丝氨酸蛋白酶体外活性检测系统 ;以该系统观察了PMSF和EDTA对蛋白酶活性的影响 .结果表明 ,PMSF能够抑制蛋白酶的酶切活性 ,而EDTA不能抑制酶的活性 .单链型HCV丝氨酸蛋白酶的成功表达以及体外活性检测系统的建立 ,为丝氨酸蛋白酶抑制剂的研制奠定了物质基础 .