摘要：目的对Ezrin mRNA的4个DNAzymes靶点AU1655、AU1751、AU1766、AU1789通过体外实验进行验证,寻找最佳的作用位点。方法同时使用RNAdraw、RNAstructure和OligoWalk 3个程序对Ezrin mRNA的DNAzymes靶点进行了设计和筛选,对最终选出的4个位点AU1655、AU1751、AU1766、AU1789进行实验研究。结果 4个DNAzymes分别命名为Dz1655、Dz1751、Dz1766和Dz1789,酶切反应结果只有Dz1751在预期的位点成功切割了ezrin全长的mRNA,得到了128 bp和1 633 bp两个片段,其他3个DNAzymes均未能有效地完成切割;反应后所剩留底物RNA中位点AU1751最少,位点AU1751是DNAzymes切割ezrin mRNA的最佳位点。结论核酸二级结构联合热动力学参数可以最大程度预测和设计DNAzymes针对ezrin mRNA的作用位点。

摘要：目的构建携带四环素真核诱导表达系统(Tet-on)调控的人骨形态发生蛋白2(h BMP-2)慢病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),为骨缺损修复提供可控的成骨活性细胞。方法设计目的基因h BMP-2引物,将扩增纯化的目的基因h BMP-2定向克隆至携带Tet-on的慢病毒GV347载体上并测序鉴定产物。h BMP-2-GV347质粒、空载的GV347质粒分别与辅助质粒共感染293T细胞以收获慢病毒浓缩液。用h BMP-2-GV347慢病毒转染大鼠BMSCs,得到h BMP-2阳性表达细胞,探索转染最佳感染复数(MOI)。用CCK8法比较BMSCs转染前后的增殖活性;强力霉素(DOX)诱导打开Tet-on,real-time PCR、Western Blot和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测转染后各组BMSCs中BMP-2蛋白及RNA的表达情况。结果 PCR后得到目的基因h BMP-2,定向克隆至携带Tet-on系统调控的GV347质粒上,经酶切后电泳、测序结果证实成功构建携带可调控系统的h BMP-2-GV347质粒。h BMP-2-GV347质粒与空载GV347质粒分别感染293T细胞后获得h BMP-2-GV347慢病毒浓缩液。在DOX诱导下,h BMP-2-GV347慢病毒载体在293T细胞内表达BMP-2蛋白。h BMP-2-GV347慢病毒载体转染最佳MOI值为9,且转染后的BMSC细胞增殖能力较普通BMSC强,并在DOX浓度为10μg/ml诱导下稳定表达BMP-2蛋白和RNA。结论本研究成功构建携带Tet-on系统调控h BMP-2慢病毒表达载体,转染BMSCs后在DOX调控下可持续高效表达BMP-2蛋白。