摘要：为研发一种更安全、有效的防控牛布氏杆菌病和分枝杆菌病的疫苗,运用在线软件ABCPerd和IEBD对牛布氏杆菌外膜蛋白(Omp25)和牛分枝杆菌抗原85A(Ag85A)的B、T细胞表位进行预测分析,设计新的表位基因肽段NewⅠ和NewⅡ,并通过SOPMA和VaxiJen在线软件对NewⅠ和NewⅡ的二级结构与抗原性进行分析。将NewⅠ、Omp25、NewⅡ和Ag85A基因序列依次用自剪切肽T2A、P2A、E2A进行连接,获得串联基因并命名为COE,将COE基因构建至真核表达载体GV658,获得重组质粒GV658-COE;将上述重组质粒转染至HEK293细胞,利用细胞计数(CCK-8)试验评估GV658-COE对细胞的安全性,通过免疫印迹分析目的蛋白的表达情况;将重组质粒以400μg/只的剂量免疫大鼠,检测在第3次免疫后的血清抗体及大鼠脾淋巴细胞中的T细胞亚群占比情况。结果显示:NewⅠ和NewⅡ序列二级结构较稳定,抗原性良好;重组质粒经PCR扩增获得3231 bp大小的目的条带,与预计相符;重组质粒对HEK293细胞无毒性作用;重组质粒在HEK393细胞中可表达出目的蛋白,分别在22.3、17.3、23.9和35.6 kDa处有目的蛋白NewⅠ、Omp25、NewⅡ和Ag85A的表达。三免后,重组质粒免疫大鼠产生的IgG水平均高于空载质粒组和PBS组;与PBS组相比,重组质粒免疫大鼠脾脏中CD4^(+)和CD8^(+)T淋巴细胞百分比均升高。研究表明,重组质粒GV658-COE能有效激发大鼠的体液免疫和细胞免疫反应,可成为预防牛布氏杆菌病和分枝杆菌病的候选疫苗。

摘要：目的构建以减毒沙门菌为载体的牛结核杆菌多表位疫苗,免疫小鼠后观察其刺激产生的免疫反应。方法运用BepiPred和IEBD对牛结核杆菌Ag85B、MPT63和HSP65的B、T细胞表位进行预测分析,设计新的表位基因肽段AMH,通过ProtParam、VaxiJen、ProtScale、TMHMM、SOPMA和SWISS-MODEL在线软件对AMH的理化性质、免疫原性、亲水性、跨膜区和空间结构进行分析,利用C-IMMSIM进行免疫模拟。将AMH、Ag85B、MPT63和HSP65基因序列用T2A和P2A连接后构建入真核表达载体pEGFP-N1。将重组质粒导入减毒沙门菌LH430,对重组减毒沙门菌进行PCR检测。取重组减毒沙门菌以每只2×10^(7)cfu/200μL的剂量灌胃免疫小鼠2次,检测末次免疫后小鼠血清抗体和细胞因子水平及脾淋巴细胞中的T细胞亚群百分率。结果共筛选出17条表位肽段,构建的表位蛋白序列AMH分子质量为30.21339 ku。生物信息学预测AMH结构稳定,亲水性高,无跨膜区,二级结构松散易与抗体结合。免疫模拟显示AMH可引起B细胞和TH细胞免疫反应,刺激抗体IgM、IgG和细胞因子IFN-γ、IL-2水平升高。重组质粒经双酶切得到4713 bp和3133 bp两条目的片段,PCR扩增的目的基因片段大小与预期相符,且重组减毒沙门菌经PCR扩增获得3133 bp的片段。与PBS组和空载减毒沙门菌组相比,小鼠经重组减毒沙门菌加强免疫后血清IgG水平显著升高(均P<0.01),细胞因子IFN-γ、IL-4和IL-10水平显著升高(均P<0.05),脾脏CD4^(+)T淋巴细胞占比和CD4^(+)/CD8^(+)值均显著升高(均P<0.05)。结论重组减毒沙门菌能激发小鼠的体液免疫和细胞免疫反应,为牛结核病新型疫苗的研制奠定了基础。