摘要：【目的】猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种对养猪业造成巨大损失的高致死率的传染性疫病。CRISPR/Cas13b系统精准切割和编辑RNA的功能提供了一种靶向抑制RNA病毒的策略。本研究尝试利用CRISPR/Cas13b的RNA干扰功能对PEDV的基因组RNA进行切割,以探索一种新型的PEDV病毒抑制策略。【方法】设计了4对靶向PEDV基因组不同区域的CRISPR RNA(crRNA)位点,构建了CRISPR/Cas13b打靶载体,以打靶载体转染Vero细胞,并利用PEDV感染转染细胞,检测PEDV在CRISPR/Cas13b转染细胞内的增殖情况。【结果】CRISPR/Cas13b系统对PEDV在Vero细胞的增殖具有明显的抑制作用。打靶载体U6-crRNA3和U6-crRNA4转染组相较于正常细胞组,病毒免疫荧光试验中荧光团明显减少;定量PCR结果显示,打靶载体转染组在细胞水平抑制50%以上病毒增殖量。【结论】本研究构建的CRISPR/Cas13b系统能有效抑制PEDV增殖,为开发有效的RNA病毒防控手段、建立抗病动物模型提供了新的研究策略。

摘要：目的:构建含有靶向乙肝表面抗原(HBsAg)基因的siRNA、乙肝复合多表位抗原基因和hIL-12共质粒表达的新型DNA疫苗,并在HepG2细胞中检测siRNA的效果以及各基因的表达。方法:设计并合成复合多表位HBV抗原基因,将其与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因融合克隆进真核表达载体pVAX1的多克隆位点中,同时将带CMV启动子的完整hIL-12表达单元克隆进载体的BspHI位点之间,再设计并合成乙肝siRNA表达单元,将其克隆进载体的MluI位点之间,得到真核三元共表达重组质粒pVAX1-siHB-HB-EGFP-hIL12。以该重组质粒瞬时转染人肝癌细胞系HepG2,通过EGFP的荧光标记观察多表位抗原的表达,以ELISA测定培养细胞上清中hIL-12的表达,以rtPCR检测siRNA对HBsAg基因的沉默效果。结果:经酶切鉴定和测序证实共表达siRNA、hIL-12的HBV多表位DNA疫苗构建成功。转染细胞中检测到绿色荧光,证实抗原表达;转染后48hhIL-12的检出量为1289pg/ml细胞上清,72h检出量为1712pg/ml细胞上清;转染后HBsAg表达量明显降低,证实siRNA效果良好。结论:成功构建乙肝复合多表位抗原基因与siRNA、hIL-12共质粒表达的DNA疫苗,并能在真核细胞中有效表达抗原与hIL-12基因,而且siRNA对HBsAg显示出明显的沉默效果,为进一步研究该复合型DNA疫苗抗HBV的治疗效果打下基础。

摘要：【目的】通过CRISPR/Cas9系统对Y染色体多位点切割,实现目标染色体的敲除,为畜禽性别控制提供新的手段。【方法】以CRISPR/Cas9技术为基础,寻找Y染色体上能被sgRNA特异性识别的多拷贝重复序列,并通过体外切割、定量分析、核型鉴定验证其对靶点的有效性。【结果】所设计的sgRNA能够在体外实现对靶片段的明显切割,且切割效率均达到了50%以上。基因的定量分析结果证明了其在细胞水平切割的有效性,且簇状重复序列切割效果明显优于散在重复序列;核型鉴定结果证实了细胞水平猪Y染色体的丢失。【结论】研究结果为后续构建染色体敲除猪,实现猪的性别控制奠定了基础。

摘要：增强型绿色荧光蛋白(EGFP, enhanced green fluorescent protein)、myc抗原和6×His已在众多真核表达载体中用作重组蛋白的表达标记,EGFP能发出的绿色荧光,myc抗原能用相应的抗体检测,6×His能被相应的树脂特异吸附。但目前为止,没有一个质粒表达载体能够同时整合三者的功能。本研究构建了一个能够同时整合EGFP、myc抗原和6×His功能的新型真核质粒表达载体,我们将其命名为pcDNA6/myc-his-EGFP B。值得注意的是,为确保目的基因与EGFP基因融合表达后,融合表达产物各组成部分能够保持原有的生物活性,我们运用LINKER程序在EGFP基因的5’端设计了一段编码八肽的连接DNA序列。将一段含有人白细胞介素2(IL-2, humaninterleukin 2)信号肽编码序列的基因亚克隆进pcDNA6/myc-his-EGFP B的多克隆位点中,使之与EGFP、myc抗原和6×His融合表达,构建成质粒pMHES。用pcDNA6/myc-his-EGFP B和pMHES转染2.2.15细胞,48h后成功观察到绿色荧光;用pcDNA6/myc-his-EGFP B尾静脉注射Balb/c小鼠,8h后在小鼠肝脏冰冻切片中同样观察到绿色荧光。用同源建模软件Modeller8V2模拟IL-2与EGFP、myc抗原和6×His融合表达产物的三维结构,结果表明:IL-2、EGFP、myc和6×His各部分互不干扰,连接八肽具有一定的柔性。以上结果表明pcDNA6/myc-his-EGFP B可望作为外源基因在哺乳动物细胞中表达研究和基因治疗的新型载体。

摘要：体细胞核移植技术在家畜良种繁育、基因修饰动物生产、濒危动物的拯救和人类疾病的治疗等领域具有重要的应用价值,但目前克隆动物生产效率较低,平均不超过5%。低下的克隆效率极大地限制了该技术的快速发展。在影响克隆猪生产效率的诸多因素中,X染色体的异常失活是导致克隆效率低下的重要原因,而与X染色体失活密切相关的一个重要基因是Xist基因,这表明Xist基因可能直接或间接地影响猪的克隆效率。本文以CRISPR/Cas系统为基础,在Xist基因上设计5个CRISPR/Cas系统打靶位点,并筛选出有效的Target 3、Target4 sg RNA,在细胞水平切割效率为1%和3%,在胚胎水平为75%和85.7%。同时将有效的sg RNA体外转录并显微注射至胚胎体内,发现Target 3和Target 4组合效果最好,敲除效率为100%。通过胞浆注射和胚胎移植方法生产出6头克隆猪,有2头活仔实现完全敲除。本文成功建立Xist基因敲除猪模型,为后续通过敲除猪Xist基因提高克隆效率的研究奠定了基础。

摘要：目的:构建多表位抗原基因、hIL-12、小分子干扰RNA(siRNA)共质粒表达的新型复合丙型肝炎DNA疫苗并在HepG2细胞中表达。方法:设计并合成复合多表位丙肝抗原基因,将其与加强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因融合克隆进真核表达载体pVAX1的多克隆位点中;利用pVAX1载体上卡那霉素抗性基因与复制起始位点之间的非功能区域,将带CMV启动子的hIL-12表达单元克隆进该区域的BspH I位点中;同时将8组针对丙肝的siRNA表达单元分别克隆进载体复制起始位点下游非功能区域的MluI位点上,构建三重表达的HCV DNA疫苗pVAX1-HC-EGFP-hIL12-siRNA。以该重组质粒转染人肝癌细胞系HepG2,通过EGFP的荧光标记观察多表位抗原的表达;以靶向EGFP的siRNA做为对照验证siRNA的表达及其干扰效果;ELISA测定培养细胞上清中hIL-12的表达。结果:经酶切鉴定和测序证实三重表达的复合HCV DNA疫苗构建成功。在转染细胞中检测到绿色荧光,证实抗原表达;靶向EGFP的siRNA亦能显著抑制EGFP的表达;转染后48 h hIL-12的检出量为1 289 ng/L细胞上清,72 h检出量为1 712 ng/L细胞上清。结论:成功地构建多表位抗原基因、hIL-12和siRNA共质粒表达的丙肝DNA疫苗,并能在真核细胞中有效表达抗原基因、hIL-12并介导RNA干扰效应。为进一步研究该DNA疫苗抗HCV的免疫治疗和基因治疗效果打下基础。

摘要：成簇的规律间隔的短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)/CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated proteins,Cas)系统是目前基因编辑、基因表达研究的热点,其中靶向RNA的CRISPR/Cas13系统的开发为RNA的干扰和编辑提供了新的方向。文中针对HEK293T细胞非同源末端连接(Nonhomologousendjoining,NHEJ)通路修复关键因子Ku70和Lig4的编码序列,设计并合成CRISPR/Cas13a、b系统相应的gRNA,检测其对ku70和lig4基因表达的影响。结果显示,Cas13a对ku70和lig4的RNA敲减效果可以达到50%以上,Cas13b对ku70和lig4的RNA敲减效果分别达到92%和76%;同时Cas13a、b系统能将Ku70和Lig4蛋白水平分别下调至68%和53%。CRISPR/Cas13系统可有效敲减HEK293T细胞RNA和蛋白质表达,为基因功能和调控研究提供一种新的策略。