摘要：目的体外构建含人LINGO-1慢病毒干扰载体,并测定其对靶基因LINGO-1的干扰效应。方法2015年3—11月,根据Gen Bank数据库中报道的人LINGO-1基因序列,设计合成针对人LINGO-1短发夹RNA(LINGO-1 shRNA)干扰序列,并将其克隆至重组质粒载体,测序验证后在293T细胞内包装慢病毒并测定病毒滴度。将慢病毒载体分为目标基因干扰载体组(实验组)和错配序列干扰载体组(对照组),并转染至人胶质细胞瘤细胞U251,荧光显微镜下观察其感染效率,并采用免疫荧光染色、实时荧光定量聚合酶链式反应(q PCR)法检测LINGO-1 mRNA表达水平,采用Western blotting法检测LINGO-1表达水平。结果成功构建两组慢病毒干扰载体,经过包装分别得到滴度为2×108TU/ml和4×108TU/ml的病毒原液。病毒载体感染人胶质细胞瘤细胞U251后,实验组和对照组载体转染效率分别为96.6%、95.2%。免疫荧光染色显示,人胶质细胞瘤细胞U251高表达LINGO-1,经慢病毒载体转染后,实验组免疫荧光呈现减弱现象。实验组LINGO-1 mRNA表达水平(0.09±0.01)较对照组的(1.00±0.00)降低(t=12.87,P<0.01),实验组LINGO-1 mRNA相对表达抑制率为91.0%。实验组LINGO-1表达水平(0.28±0.02)较对照组的(1.00±0.00)降低(t=-8.13,P<0.01)。结论本研究成功构建了含人LINGO-1shRNA干扰载体,并证实了干扰载体对靶基因有较好的干扰效果,为研究LINGO-1在轴突再生中的作用奠定了基础。

摘要：背景:细胞标记与核磁共振联合,可无创性活体标记移植的神经干细胞存在部位、存在方式及其一些生物学特性。目的:观察超顺磁性氧化铁体外标记人神经干细胞的效果。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2006-12/2007-06在解放军海军总医院儿科实验室完成。材料:流产人胚胎由解放军海军总医院提供。超顺磁性氧化铁,Lot number97060601,为Advanced magnetics,***产品。方法:取人胚胎脑海马组织,机械法分离单细胞悬液,加入含表皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子的神经干细胞培养基体外培养。取11.2g/L超顺磁性氧化铁,用神经干细胞培养基稀释成28mg/L后,加入1.0mg/L多聚赖氨酸8μL混匀,制成超顺磁性氧化铁-多聚赖氨酸复合物的标记培养基。取增殖活跃的神经干细胞球,机械吹散制成浓度为1×109L-1的单细胞悬液,加入等体积的含超顺磁性氧化铁的无血清培养液。1周后撤除各种细胞因子,添加体积分数为5%的胎牛血清诱导神经干细胞分化24h。主要观察指标:普鲁士蓝染色鉴定标记阳性率,免疫荧光染色检测分化细胞胶质纤维酸性蛋白和神经丝的表达。结果:超顺磁性氧化铁标记的神经干细胞球颜色微黄,与未标记细胞比较,其克隆形成的速度并没有减慢。经超顺磁性氧化铁标记20h后,神经干细胞胞浆中含有蓝色铁颗粒,阳性率达90%。诱导后超顺磁性氧化铁标记的神经干细胞胶质纤维酸性蛋白、神经丝均呈阳性表达。结论:在体外超顺磁性氧化铁能够高效标记神经干细胞,且标记后不影响其生物学特性,仍可以正常扩增和定向分化为神经元、星形胶质细胞。

摘要：为研究神经元限制性沉默因子(NRSF)负调控神经元及胰岛细胞中神经特异性基因的表达,拟通过RNAi的方法降低NRSF表达以进一步观察其调控的下游基因的表达情况.构建含人胰岛素启动子-荧光素酶(HIP-LUC)的pcDNA3.1报告载体.通过RNAi序列设计软件进行NRSF干涉片段及脱靶对照片段的设计,然后构建慢病毒干涉载体.包装产生慢病毒干涉毒液,用其感染HeLa细胞获得稳定干涉NRSF的细胞株,利用RT-PCR、实时定量PCR、蛋白质免疫印迹、免疫荧光染色等方法检测NRSF的干涉效果及其下游基因的表达情况,观察干涉NRSF后胰岛素启动子报告载体荧光素酶活性的变化.构建具有NRSF干涉效果的慢病毒干涉载体成功,并获得了稳定干涉NRSF及脱靶对照的HeLa细胞株,RT-PCR及实时定量PCR检测结果表明,NRSF干涉片段的干涉效率为56%(n=6,P<0.01),蛋白质免疫印迹、免疫荧光染色方法检测证实干涉后NRSF蛋白表达水平明显降低.RT-PCR实验表明干涉NRSF后下游基因开始表达,荧光素酶活性分析表明,干涉NRSF后胰岛素启动子活性增强了2.4倍(n=3,P<0.01).上述结果表明,成功构建NRSF的慢病毒干涉载体并获得稳定干涉NRSF的HeLa细胞株,干涉NRSF后,其下游基因特别是胰岛素基因开始表达.这一研究工作有助于我们进一步了解NRSF在胰岛细胞发育分化中的调控作用.