摘要：1,4-丁二醇是一种重要的化学品中间体,已被列入NICNAS高价值量工业化学品清单(HVICL).随着1,4-丁二醇的全球市场需求量不断增加,利用微生物法合成1,4-丁二醇已成为关注热点.基于多酶级联催化构建了一条以γ-丁内酯为底物合成1,4-丁二醇的路径,首先通过己内酯水解酶(ChnC)将γ-丁内酯水解为4-羟基丁酸,接着在羧酸还原酶(Car)的作用下,将4-羟基丁酸还原成4-羟基丁醛,随后,利用醇脱氢酶(YqhD)将4-羟基丁醛进一步还原生成1,4-丁二醇;同时通过引入了甲酸脱氢酶(FDH)构建了NADH/NAD+辅酶循环再生系统.最后对底物添加浓度、催化温度、pH和多酶添加比例进行了优化.综合3种酶的最适反应条件优化之后,在30℃、pH 7.0、酶活力添加比例为1:3:2的优化条件下,以5 g/Lγ-丁内酯为底物,1,4-丁二醇产量达到2.41 g/L,摩尔转化率为46.1%,与优化前相比分别提高了375.46%和374.79%.最后,通过底物补加试验,1,4-丁二醇的合成量最高达到6.31 g/L,摩尔转化率最高达到67.3%.本研究基于新设计的1,4-丁二醇多酶级联催化路径,实现了1,4-丁二醇酶法合成,结果有望为酶催化合成1,4-丁二醇及其高附加值衍生的产品提供一种新的思路.(图12表2参41)

摘要：L-谷氨酸是世界上第一大宗氨基酸产品,广泛应用于食品医药及化工等行业。以谷氨酸高产菌谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)G01为出发菌株,首先通过敲除主要副产物丙氨酸合成相关基因-丙氨酸氨基转移酶编码基因(alaT),降低了发酵副产物丙氨酸含量。其次,α-酮戊二酸节点碳流量对谷氨酸合成起重要作用,因此,采用核糖体结合位点(ribosome-binding site,RBS)序列优化降低了α-酮戊二酸脱氢酶的活性,强化了谷氨酸合成代谢流。同时通过筛选不同来源的谷氨酸脱氢酶,加强了α-酮戊二酸内源转化为谷氨酸的能力。接着,对谷氨酸转运蛋白进行理性设计,提高了谷氨酸的外排能力。最后,对基于以上策略构建的整合菌株进行了5L发酵罐发酵优化,通过梯度升温结合分批补料策略,谷氨酸产量为(136.33±4.68)g/L,较原始菌的产量(96.53±2.32)g/L提高了41.2%;糖酸转化率为55.8%,较原始菌的44.2%提高了11.6%;且降低了副产物丙氨酸的含量。以上策略一定程度上提高了谷氨酸的产量与糖酸转化率,可为谷氨酸生产菌株的代谢改造提供参考。

摘要：利用SWISS-MODEL在线服务器以栗色浑圆链霉菌(Streptomyces castaneoglobisporus)酪氨酸酶(PDB登录号:2AHL)为模板对***酪氨酸酶的3-D结构进行同源模拟。使用在线预测软件PoPMuSiC-2.1计算酪氨酸酶每个突变氨基酸的去折叠自由能变化(ΔΔG)来辅助设计提高酪氨酸酶的稳定性,利用定点突变构建突变体,并且在大肠杆菌中对野生型酪氨酸酶及突变体进行表达,最终获得了两个热稳定性提高的突变体R95Y、G123W。在此基础上进行复合突变,获得了一个热稳定性显著提高的突变体R95Y/G123W。该突变体在60℃的半衰期提高了2.43倍,最适反应温度由45℃提高到50℃,本研究所用的基于蛋白质结构的理性设计提高稳定性的策略也可以应用于其他工业酶类,显示了良好的应用前景。

摘要：亮氨酸脱氢酶(Leucinedehydrogenase,LDH)是制备L-2-氨基丁酸的关键限速酶,针对该酶的Loop区域进行改造以提高关键酶的酶活及稳定性从而高效合成L-2-氨基丁酸。通过亮氨酸脱氢酶的分子动力学模拟分析均方根涨落(Root mean square fluctuation,RMSF)值,对其波动非常明显的Loop区域合理设计以得到比酶活提高的截短突变体EsLDHD2,其比酶活为野生型的123.2%;此外,由于L-2-氨基丁酸制备过程中苏氨酸脱氨酶催化L-苏氨酸制备2-酮丁酸的速率过快导致多酶催化不平衡,因此双拷贝亮氨酸脱氢酶及甲酸脱氢酶以平衡多酶催化速率,构建多酶级联催化的单细胞***21/pACYCDuet-RM,其摩尔转化率相较于***21/pACYCDuet-RO提高74.6%;对菌株E. coli BL21/pACYCDuet-RM的全细胞转化条件进行优化,其最适pH、温度、底物浓度分别为7.5、35℃和80 g/L,此时摩尔转化率大于99%;在1 L转化体系和最适转化条件下分批加入L-苏氨酸80 g和40 g,L-2-氨基丁酸的产量达97.2g。总之,该策略为L-2-氨基丁酸的制备提供了绿色、高效的合成方法,具有工业化制备药物前体的巨大潜力。

摘要：S-2-氨基-1-苯基乙醇是一种重要的医药中间体,广泛应用于神经递质及抗病毒剂等多种具有生理活性药物的合成.目前其合成主要通过化学手段,虽然工艺成熟,但反应条件剧烈,且会生成许多副产物.基于新鉴定的铜绿假单胞菌来源的ω-转氨酶,设计了一个结合新金色分枝杆菌来源的醇脱氢酶的级联酶催化体系,从而将较为廉价的苯基-1,2-乙二醇一步催化合成具有高附加值的S-2-氨基-1-苯基乙醇.为了解决级联催化过程中辅酶再生和氨基供体再生问题,在该级联体系中引入大肠杆菌来源的谷氨酸脱氢酶,构建一个封闭的氧化还原自循环系统,从而实现辅酶(NADP+)和辅底物(L-Glu)的同时再生.最后将这3个酶串联表达在pETDuet和pACYCDuet质粒上,并转入大肠杆菌中,获得了重组菌Escherichia coli BL21(MPG).通过重组菌全细胞转化,结果显示在100 mL、pH 8.0的NH4Cl溶液中,37℃条件下反应10 h后,OD600=30的该重组菌可一步催化50 mmol/L苯基-1,2-乙二醇生成光学纯的S-2-氨基-1-苯基乙醇,转化率达到99.6%,产物的ee值>99%.本研究提供了一种高效经济催化合成S-2-氨基-1-苯基乙醇的方法,不需要受到辅因子供应不足的限制以及副产物的积累的影响.

摘要：L-天冬酰胺酶能够水解L-天冬酰胺生成L-天冬氨酸和氨,广泛存在于微生物、植物和部分啮齿类动物的血清中,在医药和食品行业中都具有重要应用。然而无论是在医药还是在食品行业中,L-天冬酰胺酶依然存在一些问题,如催化效率低、热稳定性差、产量低等。文中通过理性设计及5′非翻译区(5′untranslated region,5′UTR)改造提高米黑根毛霉Rhizomucor miehei来源的L-天冬酰胺酶(RmAsnase)的酶活及蛋白表达量。结果显示,通过同源建模结合序列比对分析构建的6个突变菌株中,突变酶A344E比酶活较野生酶提高了1.5倍。继而构建食品安全菌株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168/pMA5-A344E,对其进行UTR改造,获得重组菌株***168/pMA5 UTR-A344E,其酶活较原始菌提高了7.2倍,对重组菌*** 168/pMA5 UTR-A344E进行5 L罐研究,最终产量为489.1 U/mL。该酶活提高的重组菌株对L-天冬酰胺酶的工业化应用具有重要价值。

摘要：L-天冬酰胺酶可以催化L-天冬酰胺转化为L-天冬氨酸和氨。目前,已被广泛应用于食品和医药行业,但是由于低酶活、稳定性差等缺陷限制了该酶的应用。研究通过理性设计选择了7个位点进行点突变,以提高来源于Bacillus subtilis B11-06的L-天冬酰胺酶(Bs AII)的酶活和热稳定性。酶活测定结果表明,突变体酶H125Lansz、E145Aansz、H125L-E145Aansz的酶活较Bs AII分别提高36%、48%和64%,突变体酶E74Gansz酶活为BSAII的35.73%,H139ansz酶活几乎为0,其余突变体酶酶活较BSAII均有所降低。其中H125Lansz在40℃的半衰时间较BSAII延长3.9 h。研究表明,第125和145位氨基酸残基对酶的催化作用和蛋白结构的稳定性有较大影响,为其他来源L-天冬酰胺酶的改造提供了理论依据,并提高了该酶的工业应用潜力。

摘要：新金色分枝杆菌Mycobacterium neoaurum JC-12是一株用于转化植物甾醇合成甾体激素类药物中间体的重要菌株,传统的基因编辑方法效率低、周期长、操作复杂并且需带入抗性标签。近期CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9系统在许多非模式菌株中成功应用为本研究提供了参考。作者结合非同源黏性末端连接(NHEJ)构建了应用于新金色分枝杆菌基因组编辑CRISPR-Cas系统,对Mycobacterium neoaurum JC-12基因组上催化雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)合成雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)的3-甾酮-脱氢酶(KSDD)分别设计了敲除和转录激活的靶向sgRNA。结果显示成功敲除了ksdd基因并且突变菌株KSDD的酶活下降了80%,突变株发酵96 h的AD产量比原始菌株提高了30%,并且突变株未代谢产生ADD。转录调控结果显示,靶向-29位点相比于无靶向对照ksdd的转录水平下降了38%,而靶向-83位点和-141位点则对ksdd的转录水平分别提升了2.24倍和3.23倍,同时对应的AD和ADD的产量在对-29位点激活时没有显著变化,而AD和ADD的产量在-83位点分别提升了26%和25%,在-141位点分别提升了29.5%和36%。以上研究为进一步对新金色分枝杆菌基因组水平的代谢工程改造提供了更便捷的方式。