摘要：目的：构建针对RhoA基因的shRNA表达载体并进行鉴定。方法：针对人RhoA的mRNA序列，设计并合成编码的shRNA的两条寡核苷酸序列，经退火成互补双链，再克隆至pGPU6／GFP／Neo质粒，构建重组体pGPU6／GFP／Neo—RhoA，进行酶切及测序鉴定，然后脂质体转染LoVo细胞。荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达。结果：将合成的DNA序列退火后克隆到载体，酶切及测序证实质粒为所需的序列。结论：成功地构建了针对RhoA基因的shRNA表达载体，为下一步进行RNAi的相关研究奠定了基础。

摘要：目的探讨慢病毒载体介导的CXCR7-shRNA对人结肠癌裸鼠皮下种植瘤生长的抑制作用,为进一步研究以CXCR7为靶点的结肠癌基因治疗奠定基础。方法(1)构建CXCR7-shRNA慢病毒表达载体;(2)建立裸鼠人结肠癌荷瘤模型,计算成瘤率;(3)治疗组移植瘤内注射慢病毒CXCR7-shRNA表达载体并建立阴性对照(注射慢病毒shRNA阴性对照)和空白对照(注射PPS),测量肿瘤体积和动物体质量,计算肿瘤抑制率。结果将HT-29细胞移植到裸鼠背部皮下,成瘤率为100.0%;治疗组裸鼠的肿瘤体积较阴性对照组和空白对照显著缩小(P<0.05)、动物体质量显著增加(P<0.05)、肿瘤抑制率分别为38.0%和34.0%。结论CXCR7-shRNA慢病毒表达载体能显著抑制人结肠癌裸鼠移植瘤的生长;针对CXCR7基因序列设计的siRNA可作为具有开发前途的抗肿瘤新药,其在体实验中CXCR7的作用机制尚需进一步深入探讨。

摘要：目的探讨CXCR7的shRNA慢病毒表达载体对人结肠癌细胞HT-29 CXCR7表达的影响。方法设计CXCR7的3条siRNA的靶点序列,合成含干扰序列的双链DNA发卡结构shRNA,分别与双酶切后的plVTHM载体连接,构建3种重组穿梭质粒plVTHM shRNA1,plVTHM shRNA2和plVTHM shR-NA3,并转化于DH5α感受态细胞,Amp筛选阳性克隆,抽取质粒行酶切鉴定并测序。分别将3种重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,生产慢病毒颗粒,并检测病毒滴度。将3种重组慢病毒及阴性对照病毒分别感染人结肠癌细胞HT-29,实时定量PCR和Western blot分别检测CXCR7 mRNA和蛋白的沉默效果。结果酶切鉴定及测序结果证实3种慢病毒载体均包装成功,滴度分别为6×107TU/mL,4×107TU/mL和5×107TU/mL。感染HT-29后,CXCR7 mRNA及蛋白的表达量均较阴性对照组和未感染组明显降低(P(0.05);其中以LV-CXCR7 shRNA-2和LV-CXCR7 shRNA-3作用显著,mRNA表达分别下调72%和67%,蛋白表达下调68%和55%(P<0.05);而阴性感染对照组和未感染组相比差异无统计学意义(P(0.05)结论成功构建了3种CXCR7 shRNA慢病毒表达,可有效下调HT-29细胞CXCR7 mRNA和蛋白的表达,其为进一步研究以CXCR7为靶点的结肠癌基因治疗提供稳定转染细胞的载体奠定基础。