摘要：目的:设计并构建ErbB2的小干扰RNA,检测其对ErbB2蛋白表达的干扰效果,并检测其对乳腺癌细胞ZR75-1生长的影响。方法:设计2条针对ErbB2的siRNA,并克隆到siRNA表达载体pSliencer 2.1-U6 neo上。经酶切和测序证明构建成功后,将其与pcDNA3-FLAG-ErbB2共转染于293T细胞,以及单转siRNA于乳腺癌SKBR3和ZR75-1细胞,通过Western blot分别检测siRNA对外源和内源ErbB2的干扰效果。通过结晶紫实验研究siRNA对ZR75-1生长的影响。结果:Western blot证明构建的两条ErbB2 siRNA均能有效抑制外源和内源ErbB2蛋白的表达,并抑制乳腺癌ZR75-1细胞的生长。结论:构建的siRNA能有效地抑制ErbB2蛋白的表达并抑制ZR75-1细胞的生长。

摘要：基因的点突变体在其结构和功能研究中发挥非常关键的作用,如何高效、经济地构建基因点突变体是许多分子生物学研究遇到的棘手问题.以PIAS3点突变体的构建为对象,设计了新型的以反向PCR为基础的点突变构建流程,获得的点突变体质粒经测序后均与预期相符,并在293T细胞内得到了正确表达.以上结果表明,该实验设计方案能够高效、方便地用于基因点突变体的构建,为进一步研究它们的分子功能打下了基础.

摘要：为了探讨人造血相关的PBX相互作用蛋白质基因(HPIP)在肿瘤发生发展中的生物学作用,构建了HPIP小干扰RNA(siRNA)的真核表达载体,验证其敲减效果并观察其对细胞生长增殖的影响.根据人HPIP的cDNA序列,设计了含有小发卡结构的寡核苷酸序列,将其克隆到siRNA表达载体上;将重组质粒转染人胚肾293T细胞,通过实时定量RT-PCR及Western印迹分析检测HPIP基因的表达水平;结晶紫实验及流式细胞技术检测敲减HPIP基因表达对细胞生长和增殖的影响,软琼脂实验检测对肿瘤细胞非锚定依赖性生长的影响.结果显示,构建的siRNA能够有效抑制HPIP基因的表达;结晶紫实验与细胞周期分析实验显示,siRNA介导的HPIP表达沉默导致细胞生长增殖的显著抑制,软琼脂实验结果表明,稳定转染HPIP siRNA能够抑制肿瘤细胞的锚定非依赖性生长.上述结果初步表明,HPIP siRNA能明显抑制肿瘤细胞的生长与增殖,可能是一个潜在的肿瘤治疗新靶点.

摘要：目的:设计并构建人RSRC1基因小干扰RNA(siRNA)的真核表达载体,并观察其沉默效果。方法:以人RSRC1基因的cDNA序列为靶标,设计含有小发卡结构的2条寡核苷酸序列,并将其克隆到siRNA表达载体pSliencer2.1-U6neo上,转化大肠杆菌DH5α菌株,抽提质粒,测序正确后将重组质粒转染人胚肾293T细胞,通过Western blot和荧光分析检测其抑制效果。结果:重组体测序成功后,Western blot分析证明构建的siRNA能有效抑制外源性及内源性RSRC1表达;将siRNA重组质粒和带GFP标签的RSRC1共转染293T细胞,荧光显微镜下GFP的亮度明显减弱。结论:获得了2条人RSRC1siRNA真核表达载体,均能有效地抑制RSRC1基因表达。

摘要：目的:构建PES1基因的慢病毒干扰载体,研究其对乳腺癌细胞ZR75-30生长的影响。方法:设计针对PES1基因的siRNA引物,克隆到pSIH1-H1-Puro载体,包装成慢病毒,测定病毒的滴度,感染人乳腺癌细胞ZR75-30,通过Real-time PCR和Western印迹检测干扰效果,并通过生长曲线研究敲低PES1对ZR75-30细胞生长的影响。结果和结论:构建了具有明显干扰效果的PES1基因的siRNA慢病毒载体,能够有效抑制ZR75-30细胞内源的PES1 mRNA和蛋白水平,敲低PES1能够抑制ZR75-30细胞的生长。

摘要：目的:设计并构建人eya2(eyes absent2)基因小干扰RNA(siRNA)的真核表达载体,并观察其沉默效果。方法:以人eya2为靶基因,以pSliencer2.1-U6neo质粒为载体,根据人eya2的cDNA序列,设计含有小发卡结构的2条寡核苷酸序列,将其克隆到siRNA表达载体上;转化大肠杆菌DH5α菌株,抽提质粒,测序分析;将重组质粒转染人胚肾293T细胞,通过荧光分析、Western blot和转录活性实验检测其抑制效果。结果:重组体测序结果与目的序列相一致,证明构建了eya2 siRNA真核表达载体;荧光观察表明siRNA能显著减弱细胞中绿色荧光强度,抑制eya2基因表达;Western blot分析证明构建的siRNA能有效抑制外源性及内源性eya2基因表达;转录活性测定表明,构建的siRNA能有效抑制eya2基因表达。结论:构建了eya2 siRNA真核表达载体,该siRNA能有效地抑制eya2基因表达。

摘要：目的:设计并构建TIN-ag-RP基因的小干扰RNA(siRNA),检测其对小管间质性肾炎抗原相关蛋白(TIN-ag-RP)表达的干扰效果。方法:设计2条针对TIN-ag-RP基因的siRNA,并克隆到siRNA表达载体pSliencer 2.1-U6 neo上;经酶切和测序证明构建成功后,将重组质粒和带FLAG标签的TIN-ag-RP基因共转染293T人胚肾细胞,通过Western blot检验siRNA的干扰效果。结果:获得了2个TIN-ag-RP基因siRNA真核表达载体,均能有效抑制TIN-ag-RP的表达,其中一条的抑制效率达90%以上。结论:构建的TIN-ag-RP基因的siRNA能有效抑制TIN-ag-RP的表达。

摘要：目的:构建结缔组织生长因子(CTGF)基因的小干扰RNA(siRNA),并检测其对CTGF基因表达的干扰效果。方法:根据CTGF基因序列,设计2条合理的CTGF-siRNA,并将其克隆到siRNA载体pSliencer2.1-U6 neo中,转化大肠杆菌DH5α,挑取阳性菌落进行酶切和测序鉴定;将构建成功的CTGF-siRNA重组质粒与带FLAG标签的CTGF表达载体共同转染人胚肾293T细胞,Western印迹检测siRNA的干扰效果。结果:构建了2个CTGF-siRNA重组质粒,2条siRNA都有干扰作用,其中一条的干扰效果可达75%以上。结论:构建的CTGF-siRNA可为进一步研究CTGF的功能提供参考。