摘要：目的建立高效、稳定的人支气管上皮细胞(16HBE)的聚-ADP-核糖水解酶(PARG)缺陷细胞株,为研究PARG在环境毒物诱导细胞损伤中的作用及了解聚-ADP-核糖基化反应的功能奠定基础。方法设计并合成能编码特异靶向人PARG基因的短发夹RNA(shRNA)的oligo DNA,将之插入到真核表达载体plko.1-puro中构建重组质粒,鉴定成功后转染至正常的16HBE细胞中,RT-PCR及western blot检测完成筛选细胞株的PARG基因及蛋白水平的表达,并使用流式细胞仪分析构建成功细胞株的生长周期变化。结果重组质粒测序鉴定正确;RT-PCR及western blot检测显示最终选定的缺陷细胞株干扰效率达80%以上,效果显著(与正常细胞相比,P0.05)。结论该研究成功构建了高效、稳定的人支气管上皮细胞的PARG缺陷细胞株,为阐明ADP-核糖基化反应的作用机制及其生物学效应提供了可靠的平台。

摘要：目的:建立稳定的hsa-miR-148a-3p低表达人支气管上皮细胞株(16HBE)。方法:根据miRBase中提供的序列信息设计hsa-miR-148a-3p tough decoy RNA(TuD RNA),并将其连接到慢病毒载体pLKO.1-puro上。将重组慢病毒载体转染至293FT细胞并包装为慢病毒后,收集病毒上清,感染正常16HBE细胞。用嘌呤霉素筛选出has-miR-148a-3p低表达的16HBE细胞株,通过荧光定量PCR对其进行鉴定,然后对筛选出的细胞分别采用荧光定量PCR和Western blot检测DNA甲基转移酶1(DNMT1)mRNA和蛋白的表达水平。结果:测序结果表明含hsa-miR-148a-3p TuD RNA的重组慢病毒载体构建成功;荧光定量PCR检测显示has-miR-148a-3p低表达的16HBE细胞株has-miR-148a-3p的表达量比正常16HBE细胞低44%(P<0.01),其作用靶基因DNMT1的mRNA和蛋白表达水平分别为正常细胞的3.4倍和2.0倍(P均<0.01)。结论:成功建立hsa-miR-148a-3p低表达的16HBE细胞,hsa-miR-148a-3p的低表达能提高DNMT1 mRNA和蛋白的表达水平。

摘要：目的观察甲醛在低剂量水平时短期作用对细胞增殖及DNA损伤的影响,为进一步开展甲醛致体外细胞恶性转变的长期试验提供剂量设计依据。方法采用CCK-8法检测细胞活力,采用BrdU掺入法检测S期细胞比例,从而反映细胞增殖潜能,应用单细胞凝胶电泳结合紫外线照射的方法检测细胞DNA损伤程度。结果在24 h的作用时间下,当甲醛浓度在10-9~10-5mol/L范围内时可以增加细胞增殖率,提高16HBE细胞活力,而剂量达到10-4mol/L时可造成细胞死亡增多,降低细胞活力;同时当甲醛浓度超过10-6mol/L时可产生DNA损伤,在10-6~10-5mol/L表现为DNA断裂,当剂量达到或高于10-4mol/L,DNA蛋白质交联严重;甲醛在10-7~10-5mol/L浓度范围内可以显著增加S期细胞含量,从而促进16HBE细胞增殖。结论 10-6~10-5mol/L甲醛可以在造成16HBE细胞损伤的同时,干扰细胞周期、促进细胞增殖。