摘要：互动探索式教学法体现的是：“授人以鱼，不如授人以渔”的教学艺术。讲求的是：“师生密切配合．团结协作，互动探索，从而获取新知”的教学效果。互动探索式教学法是把每一节课的内容都作为一个“科研型的课题”来进行探索研究。教师在这里起一个“疏、导、引”的作用．每一个结果或每一个结论都是通过学生独立观察、思考、讨论或验证后得出的。课堂上学生积极动脑，勤于思考，自由发言，各抒己见表明观点，最后师生查补总结，从而使问题得以解决．课堂气氛轻松生动，活泼向上。

摘要：目的:探讨siRNA沉默survivin基因表达对胃癌细胞生长的抑制作用及其机制,为胃癌及survivin阳性肿瘤的治疗提供理论依据。方法:针对survivin mRNA序列设计合成编码siRNA的DNA模板,构建2个重组质粒pGCsilencerU6/GFP/survivin siRNA-1和-2;实验分为脂质体对照、空质粒转染对照及survivin siRNA重组质粒转染治疗组,转染胃癌细胞SGC-7901,采用RT-PCR法检测survivin mRNA的表达,Western blotting检测蛋白表达,观察重组质粒对其转染的SCG-7901细胞survivin基因表达的影响;用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测量细胞生长情况;用流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果:Western blotting、RT-PCR结果证实转染重组质粒pGCsilenerU6/GFP/survivin-siRNA-1的SCG-7901细胞survivin蛋白质及mRNA抑制率(78.25%及88.75%)均高于脂质体对照组(5%及2%)和空质粒对照组(1%及6%)(P<0.01);转染重组质粒pGCsilenerU6/GFP/survivin-siRNA-2的SCG-7901细胞survivin蛋白质及mRNA抑制率(42%及77%)也均高于脂质体对照组和空质粒对照组(P<0.01);MTT法检测结果显示转染重组质粒pGCsilenerU6/GFP/survivin-siRNA-1组细胞体外生长的抑制率(64%)高于空质粒对照组(11%)(P<0.01);流式细胞术检测的转染重组质粒pGCsilenerU6/GFP/survivin-siRNA-1组细胞凋亡率(21.20±3.21)高于脂质体对照组(0.830±0.001)和空质粒对照组(1.98±0.67)(P<0.01)。结论:重组质粒pGCsilencerU6/GFP/survivin-siRNA可抑制胃癌细胞中survivin的表达,并抑制胃癌细胞生长,促进其凋亡。

摘要：RNA干扰(RNAi)是一种转录后的基因缄默.它能触发某种转录后监控程序,导致特定mRNA单链的降解[1-3].我们利用RNAi技术,针对survivin基因的2个不同部位设计2对编码小干扰RNA(siRNA)的DNA模板,用基因重组的方法将其置于质粒pGCsilencer的U6启动子下,构建pGCsi-lencer-survivin siRNA重组质粒,转导人白血病K562细胞,以阻抑survivin基因的过度表达,诱导K562细胞凋亡.期望为肿瘤的基因治疗提供实验基础。

摘要：目的构建靶向增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)的RNA干扰质粒载体。方法设计并合成针对EGFP编码区的模板寡核苷酸单链,克隆入pSilencerTM 3.1-H1 neo载体中,对重组质粒进行酶切鉴定和DNA序列测定。结果重组质粒经限制性内切酶酶切得到66 bp和4.3 kb条带;重组阳性克隆测序结果与实验设计的模板寡核苷酸序列相符。结论成功构建靶向EGFP的RNA干扰表达载体,为RNA干扰技术在实验室的进一步开展奠定基础。

摘要：目的探讨 mdr1短发夹 RNA(mdr1 shRNA)对人红白血病耐阿霉素细胞系 K562/ADM的耐药逆转作用。方法编码设计合成靶位 mdr1基因 mRNA 具有19个碱基发夹结构互补的寡核苷酸模板,构建2个 shRNA 表达载体 pSilencer^(TM)3.1-H1 neo mdr1-A和 mdr1-B,将其稳定转染 K562/ADM细胞。用 RT-PCR 法检测转染后 K562/ADM 细胞 mdr1 mRNA 表达,Western blot 检测 P-糖蛋白(P-gp)表达,流式细胞术和 MTT 法分别检测 K562/ADM 细胞凋亡和对阿霉素的敏感性,用激光共聚焦荧光显微镜观察并测定细胞内柔红霉素的积累。结果在 pSilencer^(TM)3.1-H11 neo mdr1-A 和 mdr1-B shRNA表达载体稳定转染的 K562/ADM 细胞,mdr1 mRNA 表达分别减少到转染前的35.9%(P<0.05)和27.5%(P<0.01);同时 Western blot 结果显示 P-gp 表达被明显而特异地抑制,对阿霉素的耐药性由79倍分别减低到38倍和30倍;并且,细胞内荧光强度与对照组相比显著增加(P<0.05),与阿霉素联合应用凋亡细胞百分率分别增加至18.1%(P<0.05)和54.4%(P<0.01)。结论靶向 mdr1基因shRNA 表达载体可有效逆转耐药,使耐药的肿瘤细胞恢复对化疗药物的敏感性。

摘要：目的:探讨人白细胞介素12(IL-12)两个亚基基因通过连接肽基因进行拼接的新方法。为进一步研究IL-12基因的生物学功能以及应用提供实验基础。方法:采用两个牛弹性蛋白基序(10个氨基酸)的基因序列为两个亚基基因拼接的连接肽基因。根据人IL-12p35、p40两个亚基基因片段以及连接肽基因核苷酸序列设计引物,其中p40基因下游引物包括部分连接肽基因序列以及KpnⅠ酶切位点,p35基因上游引物包括部分连接肽基因序列以及KpnⅠ酶切位点。通过聚合酶链反应(PCR)方法分别获得人IL-12p35与p40基因片段。利用KpnⅠ内切酶对p35与p40基因的PCR产物进行酶切,酶切产物回收后利用T4DNA连接酶进行连接,应用p40基因上游引物与p35基因下游引物对连接产物进行PCR扩增。利用KpnⅠ内切酶对连接产物进行酶切鉴定。将扩增的连接产物克隆入T载体,挑选阳性克隆并进行酶切鉴定,酶切鉴定正确的克隆进行拼接产物的核苷酸序列测序。结果:通过PCR分别获得约1000bp大小的p40基因片段与600bp大小的p35基因片段,两个基因酶切片段连接后PCR扩增获得1600bp左右的拼接产物,采用KpnI内切酶对拼接产物进行酶切后获得约1000和600bp大小的基因片段,分别与p40和p35基因片段大小一致。拼接产物的T载体经酶切鉴定可见1600bp大小的酶切产物,拼接产物测序结果与GenBank核酸数据库上的p40基因、p35基因以及连接肽基因核苷酸序列完全一致。结论:利用该基因分子拼接技术成功地将人白介素12两个亚基基因通过连接肽基因进行拼接。建立了一种简单、方便、有效进行人白细胞介素12两个亚基基因拼接的新方法,为进一步研究IL-12的生物学功能以及基因治疗提供实验基础。

摘要：目的建立稳定、有效地检测错配修复(Mismatch Repair,MMR)基因突变的方法。方法对30例肠癌及癌旁正常组织标本分别提取DNA,设计错配修复基因hMSH1引物,应用聚合酶链式反应进行PCR扩增,10%聚丙稀酰胺凝胶电泳PCR产物,银染等技术检测分析错配修复基因hMSH1突变;hMSH1抗体为一抗,免疫组化法检测30例肠癌及例癌旁正常组织石蜡切片中hMSH1蛋白的表达。结果30例肠癌组织中发生错配修复基因hMSH1突变4例(发生率13.3%),10例癌旁正常组织中无一例发生错配修复基因hMSH1突变;免疫组化检测到30例肠癌组织中有6例hMSH1蛋白表达阴性,其中hMSH1基因突变的组织hMSH1蛋白均未表达,正常组织中hMSH1蛋白表达正常。结论PCR-SSCP银染法是检测错配修复基因突变的简捷、稳定、有效的方法之一。可成为早期诊断肿瘤发生的分子手段。在肿瘤的早期治疗中具有重要作用。

摘要：目的应用改良的Apo E基因多态性检测方法快速、准确的筛查体检除外冠心病的健康人群的Apo E基因型,并以已知基因型的质粒作准确对照,证实改良的Apo E基因多态性检测方法的有效性和可靠性。方法采集健康体检者清晨空腹血,用试剂合提取白细胞基因组DNA,设计引物,应用聚合酶链式反应(PCR),扩增包括编码112位和158位氨基酸的ApoE基因片段,用限制性内切酶AflⅢ和HaeⅡ消化PCR产物,经琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统扫描电泳结果,在标准分子量对照下鉴定不同个体的ApoE基因型。同时以已知的ApoE2,E3,E4质粒为模板扩增ApoE基因片段,内切酶AflⅢ和HaeⅡ消化PCR产物进行对照。结果ApoE2,ApoE3,ApoE4经AflⅢ酶切分别得到231 bp、231 bp2、31 bp+295 bp片段;经HaeⅡ酶切,分别得到267 bp、231 bp2、31 bp片段。结论改良的Apo E基因多态性检测方法在保持准确性的同时,与传统的PCR-RFLP方法相比耗时少,成本低,毒性小,是对传统方法有益的改良。

摘要：目的:设计并构建靶向mdr1基因shRNA真核表达质粒。方法:以mdr1为靶基因设计具有短发夹结构的模板寡核苷酸,退火形成互补双链结构,再克隆至pSilencerTM3.1-H1neo载体,构建重组的短发夹shRNA表达载体。采用酶切法和测序法鉴定。结果:经限制性内切酶酶切电泳后显示有66bp模板寡核苷酸片段和4.3kbp的线性化的pSilencerTM3.1-H1neo载体片段。重组子测序结果与Genebank中的mdr1基因cDNA序列相符。结论:重组靶向mdr1基因shRNA表达载体构建正确,为进一步转染耐药的肿瘤细胞逆转肿瘤耐药研究奠定了基础。

摘要：本文根据多年计算机图像分析系统的使用经验,结合免疫组化图像分析的特点,详细分析了免疫组化图像计算机定量分析的主要环节及诸多方面的影响因素,尤其对免疫组化图像测量参数及测量方法的选择和设计进行了较深入的探讨。旨在提高免疫组化图像计算机定量分析数据的科学性、可靠性、可重复、可比性,尽可能避免人为因素对测量结果的影响。