摘要：目的对阳春砂萜类合成关键酶龙脑基二磷酸合酶(bornyl diphosphate synthase,BPPS)催化生成龙脑基二磷酸(bornyl diphosphate,BPP)的关键氨基酸位点解析,为阳春砂BPPS的功能优化并且促进其在代谢工程中的应用奠定基础。方法比较阳春砂、海南砂的BPPS (AvBPPS、A1BPPS)及已报道的其余3种植物的BPPS,发现AvBPPS催化产生BPP的比率较高。通过分子建模和底物对接、保守基序预测,以及与其他BPPS、单萜合酶序列多重比对的方法,筛选关键氨基酸位点,探索决定AvBPPS产生BPP及其较高比率BPP的关键活性位点,据此设计突变体,并用快速定点突变的方法获得突变体。结果筛选出了20个可能影响AvBPPS催化的关键位点,并根据这些位点,设计了20个AvBPPS突变体及1个A1BPPS突变体,成功构建其中17个突变体,诱导表达获得了纯化蛋白。结论综合使用多种分析方法,理性设计BPPS的突变位点,并获得了相应突变体及蛋白,为通过氨基酸定点突变探索BPPS的催化机制及功能优化提供了基础。

摘要：9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶（NCED）是高等植物ABA生物合成途径中的关键酶，本研究以3种豆科植物NCED的同源序列设计简并引物，用RT—PCR结合RACE以及嵌套PCR的方法。从柱花草叶片中克隆了一个编码NCED的基因，命名为SgNCED1。其cDNA全长2241bp，开放阅读框架为1809bp，编码602个氨基酸。Southern杂交结果表明，该基因在柱花草基因组中以单拷贝形式存在。氨基酸序列同源比对和系统进化分析表明SgNCED1与花生的AhNCED1高度同源（92％），与另外3种豆科植物的NCED也有很高的同源性（72％～75％）。亚细胞定位预测表明SgNCED1蛋白的N-末端具有叶绿体转运肽。叶片脱水诱导的SgNCED1基因的表达与内源ABA的积累、变化同步。

摘要：目的阳春砂是中药砂仁的主要来源植物,其转录组中已筛选出预测与萜类合成相关的候选转录因子unigene,对其进行克隆、序列分析和原核表达,以进一步认识阳春砂药效物质萜类合成的调控元件。方法根据阳春砂转录组数据中预测为AvMYC4b的Unigene0074125序列设计特异引物,提取阳春砂叶片RNA并反转录成c DNA,以此为模板经PCR扩增得到AvMYC4b的核心片段,再通过RACE技术获得全长c DNA,然后进行编码区全长的GATEWAY TOPO克隆。通过LR反应构建原核表达载体,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)细胞,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和阿拉伯糖在16℃下培养诱导融合蛋白表达,收集菌体,经过裂解、超声、纯化,用SDS-PAGE检测蛋白表达结果。结果克隆获得的AvMYC4b全长有2 579 bp,包含195 bp的5’UTR,1 995 bp的ORF和389 bp的3’UTR,编码664个氨基酸,预测蛋白相对分子质量为72 211。经过生物信息学分析,AvMYC4b氨基酸序列与其他植物的MYC相似,含有转录因子MYC家族的保守结构域,预测可定位于细胞核中。成功构建重组表达载体p DEST17-AvMYC4b并转化Rosetta(DE3)细胞,经诱导表达得到AvMYC4b融合蛋白,SDS-PAGE结果显示蛋白相对分子质量约80 000,与预测相符。结论从阳春砂中克隆得到b HLH家族转录因子AvMYC4b,并建立了AvMYC4b原核表达系统,为该转录因子的生物功能研究奠定了基础。

摘要：为了建立丁公藤扦插繁殖和组织培养方法,设计正交实验,考察插枝长度、插枝浸润和浇灌的生根液浓度对丁公藤扦插存活及出芽的影响,考察不同种类和浓度的植物激素以及来源于不同叶位的外植体对丁公藤愈伤组织诱导的影响。根据正交试验结果,丁公藤扦插繁殖的最优条件组合为:扦插前浸润生根液浓度为15%、插枝长度为10～12 cm、扦插后浇灌生根液浓度为0.1%,扦插后第43 d的最高存活率和出芽率分别达到87.5%和50%;诱导愈伤组织的最优培养基为MS+0.25 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L6-BA+0.5 mg/L NAA+2 g/L Na2S2O3,室内培养的扦插苗第2位叶为诱导愈伤组织的最适外植体,诱导率最高达94.44%。建立了丁公藤扦插繁殖和愈伤组织诱导方法,为通过人工快繁缓解丁公藤资源紧缺提供了基础。

摘要：目的获得药用植物阳春砂Amomum villosum萜类合酶基因Av BPPS(bornyl diphosphate synthase)、AvLIS(linalool synthase)和AvHUS(humulene synthase)的启动子,探究其顺式作用调控元件参与萜类合成的调控。方法从阳春砂叶片基因组DNA(genomic DNA,gDNA)中分别克隆获得AvBPPS、AvLIS和AvHUS的gDNA序列,据此设计特异引物,再通过FPNI-PCR(fusion primer and nested integrated PCR,FPNI-PCR)方法分别克隆其启动子并进行生物信息学分析,结合转录组及对应萜类含量数据,分析其较为关键的顺式作用调控元件与萜类调控的关系。结果获得Av BPPS、AvLIS和AvHUS的gDNA长度分别为2374、2295、2362 bp,均包含相应基因的完整编码区和7个外显子。进一步克隆获得470、934、762 bp的启动子。AvBPPS启动子含有参与胚乳表达的顺式作用调控元件GCN4-motif,结合基因表达量的分析,该顺式作用调控元件调控了AvBPPS在阳春砂药用部位种子中的特异表达,进而影响了主要药效萜类成分龙脑、乙酸龙脑酯等在种子中的积累。AvLIS和AvHUS启动子均含有参与茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)反应的顺式作用调控元件,转录组和萜类含量的分析显示AvLIS响应高浓度MeJA的诱导,而AvHUS没有表现出对MeJA的响应。结论首次从药用植物阳春砂的启动子中发现了参与胚乳表达和MeJA反应的调控元件,为深入探究萜类合成关键酶的种子表达特异性和对MeJA响应的机制提供了基础,为萜类代谢的调控提供了操作元件。