摘要：目的 建立基于多重PCR技术的肠球菌万古霉素高水平耐药基因vanA、vanB、vanD和vanM的快速分型检测方法。方法 通过分析可介导肠球菌万古霉素高度耐药的D-丙氨酸∶D-乳酸（D-Ala∶D-Lac）连接酶基因序列差异，设计可同时检测肠球菌万古霉素高水平耐药基因vanA、vanB、vanD和vanM的多重PCR分型检测方法，以含vanA、vanB、vanD和vanM基因的重组质粒为阳性对照，以临床常见病原菌DNA为阴性对照，评价其敏感度及特异度。采用新建方法检测50株万古霉素耐药临床分离株，50株万古霉素耐药肠球菌（VRE）临床株于2006年1月至2014年12月分离自上海地区9家医院，并与常规PCR及测序方法比较。结果 vanA、vanB、vanD和vanM基因核苷酸序列一致率为60.8%～71.3%，根据序列差异建立的分型方法可对不同基因型阳性对照样品进行准确分型。所有阴性对照样品均未出现假阳性。检测50株临床分离VRE，18株为vanA型，32株为vanM型，与常规PCR及测序方法比较，敏感度及特异性度均为100.0%。检测下限2×10拷贝/PCR反应，检测可在3.5 h内完成。结论 建立了一种基于多重PCR技术的VRE万古霉素高水平耐药基因快速分型方法，可用于VRE菌株的分子流行病学研究及检测。

摘要：目的通过临床常见致病菌23SrRNA基因序列差异的分析,探索建立可同时检测或鉴定多种细菌的分子生物学方法。方法对常见致病菌23SrRNA基因的一个多变区序列进行聚合酶链反应(PCR)扩增和测序分析,根据序列差异设计相应引物和探针,并采用PCR凝胶电泳分析和PCR反向杂交技术检测或鉴定临床常见致病菌。结果1.革兰阳性菌和革兰阴性菌间的23SrRNA基因序列存在较大差异,通过PCR扩增和凝胶电泳分析能快速区分待测菌株为革兰阳性菌抑或革兰阴性菌;2.不同菌种间亦存在一定差异,可通过PCR反向杂交技术将细菌鉴定到种。结论临床常见致病菌的23SrRNA基因之间存在可供细菌鉴定的序列差异,据此可望建立各种具有快速、灵敏、准确特点的分子生物学方法,为细菌感染的快速病原诊断提供客观依据。

摘要：目的　建立基于 2 3SrRNA基因的一种常见病原菌菌种鉴定的分子生物学方法。　方法　使用地高辛标记的通用引物扩增常见病原菌的 2 3SrRNA基因 ,并在尼龙膜上固定根据扩增产物序列设计的菌种特异性探针 ,根据反向杂交结果判断病原菌种类。选取临床分离获得的菌株验证该方法的有效性。结果　通用引物可特异性扩增细菌 2 3SrRNA。应用该方法可鉴定金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、肺炎链球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌、阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌、绿脓假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌和洋葱伯克霍尔德菌。检测临床标本结果显示 ,与常规培养方法的符合率为 99%。结论　该方法可用于常见病原菌的鉴定。

摘要：目的　根据临床常见致病菌 2 3SrRNA基因序列的差异 ,建立可初步鉴别革兰阴性菌和革兰阳性菌的分子生物学方法。方法　分析常见细菌的 2 3SrRNA基因序列 ,设计相应引物。采用多重PCR扩增标准菌株及临床分离株 2 3SrRNA基因 ,并根据电泳结果作出初步分类。结果　革兰阴性菌株均出现 1条DNA电泳条带(约为 35 0bp) ,而革兰阳性菌株则出现 2条电泳条带 (约为 2 5 0和 4 0 0bp)。 6 0株临床分离菌经PCR扩增、电泳后 ,电泳分析结果与常规鉴定结果符合率达 10 0 %。结论　 2 3SrRNA基因检测用于细菌初步分类鉴定 ,具有快速、灵敏、准确的特点 。

摘要：目的快速、准确、灵敏地检测临床常见的致病菌及其耐药基因。方法采用基因芯片技术，利用细菌23S rRNA基因序列信息和某些耐药基因作为检测靶基因，设计针对不同菌属的寡核苷酸探针和耐药基因探针的基因芯片，聚合酶链反应（PCR）扩增并荧光标记目的DNA片段，通过杂交反应检测致病菌及其耐药基因。结果在理想状态下（检测试剂盒抽提的细菌基因组DNA）检测的结果与国内外文献报道的灵敏度相当（10^3～10^6细菌／ml），并在部分临床分离株、耐药标准菌株中进行验证，显示该方法有良好的特异性及可重复性。细菌种类能鉴别到种水平的有16种，能鉴别到属水平的有7类。覆盖了临床常见的多种病原菌，并且还可同期检测超广谱β内酰胺酶（ESBLs）基因耐药。结论DNA芯片检测具有快速、高特异性和高灵敏度的特点，是常规鉴定方法的一种有益补充。

摘要：目的建立细菌感染患者早期病原及耐药性分子诊断技术,以便尽早实施有效的抗感染治疗方案,改善患者预后。方法扩增细菌23S rRNA基因序列,同时扩增多种耐药基因,设计探针,通过基因芯片杂交技术识别其差异序列,鉴别细菌,检测耐药基因,用于病原早期诊断和耐药谱测定;收集血培养标本223份,脑脊液、胸水、腹水标本339份,尿液标本514份,比较所建立方法与传统方法的一致性,验证所建立技术的可靠性。结果基因诊断方法可正确检出常见病原菌,并检测其是否携带mecA、SHV、CTX-M-1组和CTX-M-2组耐药基因。检测血、尿及脑脊液等无菌体液标本时,所建立的快速检测方法与常规方法的符合率分别为96.4%、99.8%和99.7%,总体符合率为99.1%,耐药性检测与传统药物敏感结果的符合率为95.7%,其准确性与常规方法相当,检测时间比常规方法平均减少(2.09±1.15)d。结论多重PCR-基因芯片杂交技术可用于耐药菌感染的病原早期诊断和耐药感染的同步检测,应用于临床可望改善患者的预后。