摘要：转录因子E2相关因子2(Nrf2)是细胞重要的调节抗氧化应激的转录因子,其活性状态与病毒感染引起的炎症及免疫清除相关。为研究Nrf2对马传染性贫血病毒(EIAV)复制的影响,本研究通过CRISPR在线设计工具,靶向于Nrf2设计2条特异性sgRNAs,经程序性退火后连接到LentiCRISPRv2-GFP载体中构建重组质粒并分别经测序鉴定正确后,转染HEK293T细胞,24 h后通过western blot筛选沉默Nrf2基因效率最高的sgRNA,结果显示,2条sgRNAs均具有较高的沉默效率。将重组质粒LentiCRISPRv2-GFP-sgRNA-N1转染HEK293T细胞,利用流式细胞仪筛选表达GFP的单细胞克隆,并扩大培养后,经western blot和测序鉴定,筛选到2株不表达Nrf2的细胞,这2株细胞基因组均缺失一个碱基T,导致Nrf2基因发生移码突变而无法表达。选择其中一株细胞,将该细胞连续传代,选择第10代(G10)、15代(G15)、20代(G20)细胞经western blot鉴定其遗传稳定性,结果显示各代次细胞均未检测到Nrf2基因的表达,表明该敲除细胞系可稳定遗传,将其命名为HEK293T-Nrf2^(KO)细胞。将EIAV感染性克隆CMV_(3-8)及Nrf2基因回补的感染性克隆CMV_(3-8)+pVR_(1012)-flag-Nrf2分别转染HEK293T-Nrf2^(KO)细胞,24 h后收获细胞和上清,通过western blot分别检测细胞和上清中的病毒蛋白Gag及利用反转录酶活性试验(RT)检测上清中病毒的复制。western blot结果显示,与CMV_(3-8)转染的HEK293T细胞相比,转染CMV_(3-8)的HEK293T-Nrf2^(KO)细胞和上清中病毒蛋白Gag表达均上调约1.5倍,而转染CMV_(3-8)+pVR_(1012)-flag-Nrf2HEK293T-Nrf2^(KO)细胞和上清中的病毒蛋白Gag表达下调约50%;RT的检测结果与western blot的检测结果一致。结果表明Nrf2基因可以抑制EIAV在HEK293T细胞中的表达。通过将相关质粒转染HEK293T细胞包装EIAV假病毒,并将其分别感染HEK293T和HEK293T-Nrf2^(KO)细胞24 h后,分别检测病毒的荧光素酶信号,结果显示,与对照组相比,感染假病毒的细胞病毒复制能力显著增强。进一步表明,敲除Nrf2基因有助于病毒对细胞的感染。以上结果表明,Nrf2能够抑制EIAV在HEK293T细胞中的复制。本研究利用CRISPR/Cas9技术构建的敲除Nrf2基因的HEK293T细胞系,可以用于研究宿主Nrf2对EIAV复制的影响,本研究首次证实了宿主Nrf2可以抑制EIAV的复制。本研究构建的HEK293T-Nrf2^(KO)细胞系为宿主Nrf2调控EIAV复制机制的研究提供了有效工具。

摘要：马传染性贫血病毒(equine infectious anemia virus, EIAV)弱毒疫苗是中国科学家在20世纪70年代研制成功的世界上首例慢病毒疫苗,是迄今为止唯一在临床大规模应用的慢病毒弱毒疫苗。EIAV弱毒疫苗的成功应用不仅消除了该疫病对马业的威胁,而且在学术上突破了慢病毒不能免疫的理论。该疫苗克服了灭活疫苗免疫原性差的难点,能有效地提供对同源和异源毒株的免疫保护。因此,在分子水平上阐明EIAV弱毒疫苗的减毒机理和免疫保护机制对于研究慢病毒免疫保护具有极其重要的科学意义。作者所在的研究团队多年来一直从事EIAV弱毒疫苗的致弱机理及其诱导免疫保护机制的研究,解析了EIAV弱毒疫苗及其强毒株的基因组进化特征、揭示了疫苗致弱规律和疫苗有效组成、提出了"EIAV弱毒疫苗可能起源于EIAV准种的一个小分支"的假说;发现EIAV弱毒疫苗可有效激活天然免疫和特异性免疫,早期诱导的高水平细胞免疫与免疫保护呈正相关;证明了疫苗株的抗原多样性组成是其诱导保护性免疫应答的关键因素。相关研究成果拓展了慢病毒疫苗研究理论和实践认知,可为其他慢病毒尤其是HIV-1免疫原的设计以及免疫保护理论提供有价值的参考。