摘要：为制备小反刍兽疫病毒(PPRV)非结构蛋白C单克隆抗体,根据PPRV C基因编码多肽链氨基酸序列抗原性分析,设计合成一条含20个氨基酸的抗原肽(CRSGKPRGETPGPLLPEIMQ)和一条含21个氨基酸的筛选抗原多肽(PLRAGERGLAPQAVQHRTLIK),将它们分别与钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin, KLH)和生物素羧基蛋白(biotin carboxyl carrier protein, Biotin)交联,制备获得免疫原和筛选抗原。用免疫原肌肉注射5只8~12周龄、体重约20 g的无特定病原体(specific pathogen free, SPF)级BALB/c雌性小鼠,第1次免疫后分别间隔7 d进行第2次免疫和第3次免疫,三免后21 d进行冲击免疫,冲击免疫后第3天采集血液分离血清,采用间接酶联免疫吸附法(ELISA)测得1只免疫小鼠血清抗体效价为1∶312 500,2只为1∶62 500。取3只小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0经聚乙二醇(PEG)融合制备杂交瘤细胞,通过间接ELISA筛选出26株阳性淋巴杂交瘤细胞,进一步经克隆化培养筛选出46株单克隆细胞株。通过Western blot(WB)筛选获得2株能稳定分泌特异性抗PPRV C蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,WB、间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay, IFA)鉴定显示,制备的单克隆抗体具有较好的灵敏性和病毒反应性。研究结果为进一步阐明C蛋白在PPRV生命周期中的作用奠定了基础,也为小反刍兽疫(PPR)诊断提供了有效的诊断试剂。

摘要：网络教学是学校教育与现代媒体应用技术融合发展的必然,也是新时代高校思政教学和课程教学的一种发展方向。积极推行线上和线下教学相结合的综合性教学之路,为我国高等教育探索出一条全新的发展格局,优化网络教育教学,提高线上教学质量是当下每一位专任教师教学使命,但也由于不同学校硬件设施的建设、学生的基础知识、网络素养以及学习环境的差异等问题,使线上教学有很多的优点但也有一些不足,本文从线上教学的现状、突出的问题以及优化策略进行论述,以便为今后线上教学模式的选择和教学设计等方面提供一定的参考价值。

摘要：克隆并原核表达小反刍兽疫病毒弱毒疫苗株血凝素蛋白(H)全长基因,并通过生物信息学的方法预测其B抗原表位。根据NCBI中PPRV基因组序列中H基因序列(GenBank X74443)设计一对引物,采用RT-PCR方法扩增其全长;将扩增产物克隆至原核表达载体pET-32a后,转化至大肠杆菌E. coli Rosetta,经IPTG 37℃诱导表达目的蛋白;表达的目的蛋白经带His标签的镍离子蛋白纯化柱纯化后,进行Western Blot鉴定。利用DNAStar软件采用生物信息学的方法预测其H蛋白潜在的抗原表位。结果显示,质粒pET-32a-H经双酶切鉴定及测序后可证明构建正确;表达的目的蛋白相对分子质量约67 ku,能被抗His标签抗体识别,主要以包涵体形式存在,有少量可溶性表达。通过生物信息学软件DNAStar成功找到H蛋白的潜在抗原表位5-8,14-16,73-75,83-90,125-131,142-147,170-177,236-245,281-285,312-317,360-363,370-379,388-391,445-449,487-489,503-505,520-522,532-535,544-551,592-595。试验成功构建阳性质粒pET-32a-H,表达目的蛋白,并成功预测出H蛋白潜在的抗原表位。为早日消除PPRV研制新型亚单位疫苗提供参考。

摘要：为研制葡萄球菌蛋白A(staphylococcal protein A,SPA)的相关免疫试剂盒,设计了1对引物,从金黄色葡萄球菌基因组中扩增出了876bp的细胞壁结合蛋白SPA基因,该基因编码292个氨基酸,包含了E、D、A、B、C 5个IgG结合结构域。构建了原核表达载体pET28a(+)-SPA,经IPTG诱导,表达出分子质量约35.0ku的SPA蛋白,并应用亲和层析柱纯化了SPA蛋白,Western-blot分析表明纯化的SPA蛋白具有生物学活性。

摘要：为了建立一种快速检测小反刍兽疫病毒的方法。根据Gen Bank中公布的PPRV Nigeria75/1株H基因序列设计2对引物,PCR扩增出1 830 bpH基因,构建标准质粒p MD-18-H。以标准质粒优化反应条件,建立了小反刍兽疫病毒H基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法。最优反应体系25μL:2×SYBR qPCR Mix 12. 5μL,模板DNA 1μL,特异引物各0. 2μL(0. 2μmol/L),DEPC H2O 10. 5μL;最佳反应条件:94℃2 min; 94℃5 s,57℃30 s,40个循环,Ct值与标准质粒模板浓度在3. 28×104～3. 28×10-2copies/μL 7个浓度梯度呈良好线性关系y=-2. 913x+36. 904,斜率为-2. 913,扩增效率120. 5%,相关系数R2=0. 994。建立的实时荧光定量PCR检测方法比普通PCR灵敏度高10 000倍,稳定性好,特异性强,对PPRV的准确诊断和定量检测具有重要意义。

摘要：克隆兰州大尾羊促分裂素原活化蛋白激酶MAPK13基因,并分析其序列及其编码蛋白的生物学特性,为研究绵羊MAPK13基因的功能和生产应用提供参考。根据绵羊MAPK13基因CDS序列设计特异引物,利用RACE和RT-PCR技术克隆获得兰州大尾羊MAPK13基因全长序列,并结合生物信息学方法分析其生物学特性。克隆获得兰州大尾羊MAPK13基因cDNA序列全长1 397 bp,其CDS区片段长1 102 bp,编码367个氨基酸。预测兰州大尾羊MAPK13蛋白分子量为42.29 kD,理论等电点为8.82,为非跨膜的疏水性蛋白,亚细胞定位主要在细胞质中,无信号肽,不属于分泌蛋白。预测其氨基酸序列有19个磷酸化位点,3个糖基化位点,3个磷酸化功能结构域,4个其他结构域,1个LCR片段,二级结构以α-螺旋为主。同源性分析显示兰州大尾羊MAPK13基因序列与已发布的绵羊MAPK13 mRNA序列(登录号:NM_001139455.1)相比,其第852位发生碱基转换(CA),导致编码蛋白第265位氨基酸发生碱基转换(ST),同时,第951位发生碱基转换(TG),但其所编码氨基酸不变。构建的基因进化树分析结果显示兰州大尾羊与牛亲缘关系最近。兰州大尾羊与其他物种MAPK13基因在结构上相似性较高,说明该基因具有高度的保守性,其序列包含的S_TKc结构域可将ATP的γ磷酰基转移到蛋白质丝氨酸/苏氨酸残基上,导致一系列肥胖相关基因的功能失调和表达变化,为进一步研究MAPK13基因与成脂分化过程的相关性提供了参考。

摘要：为研究牛病毒性腹泻病毒的囊膜糖蛋白E1的抗原性,参考了Oregon C24V BVDV毒株的基因组序列(AF091605.1),并设计一对特异引物(上游引物5’-CCC GGA TCC ATG GCC TCT CCC TAC TGT-3’,下游引物5’-GGG CTC GAG TTA CCC TTG TGC TCC TGT T-3’),利用RT-PCR从病毒基因组中扩增E1基因609 bp全长片段,测序结果表明,与C24V株核苷酸同源性达100%.扩增产物经BamHI和XhoI双酶切,亚克隆至原核表达载体,双酶切鉴定表明成功构建了重组表达载体pET-32a(+)-E1.重组表达载体转化BL21(DE3)宿主菌,IPTG诱导表达,经SDSPAGE和Western-blot检测,成功诱导表达出25ku E1蛋白.实验结果为进一步研究BVDVE1蛋白的功能提供了参考.

摘要：为研制SPG相关免疫试剂盒,设计了1对引物,从C群链球菌C40株基因组中扩增出了387 bp的细胞壁结合蛋白G(streptococcal protein G,SPG)基因,该基因编码125个氨基酸,包含了C1和C2两个Ig G结合结构域.构建了原核表达载体p ET28a(+)-SPG,IPTG诱导表达出分子质量约15.0 ku的SPG蛋白,并应用亲和层析柱纯化了SPG蛋白,Western blot分析表明纯化SPG蛋白具有生物学活性.

摘要：目的:克隆天祝白牦牛转铁蛋白(Transferrin,Tf)基因,并对其序列及蛋白进行遗传特性分析,为研究Tf生物学作用和生产应用提供理论依据。方法 :以成年天祝白牦牛肝脏组织为实验材料,根据牦牛Tf基因CDS区序列设计引物,利用PCR和逆转录PCR(reverse transcription,RT-PCR)技术克隆获得天祝白牦牛Tf基因编码区序列,并结合生物信息学方法分析其遗传特性。结果:PCR扩增获得了大小为2 115 bp的基因片段,为Tf基因的完整编码区,编码704个氨基酸,其N端有一个19个氨基酸组成的信号肽,含2个高度保守的同源结构域,N端结构域组成为第25到363位氨基酸(339aa),C端结构域组成为第364-693位氨基酸(330aa),两端结构域的同源性为42%;Tf基因编码的蛋白分子量为75.78 k Da,理论等电点为6.63。序列分析显示,克隆获得的Tf基因序列存在4个碱基的变异,第57位发生碱基转换(A←→G),第750位发生碱基转换(T←→C),为同义突变;第482位发生碱基转换(A←→T),第511位发生碱基转换(T←→C),为错义突变,引起第161、171位氨基酸发生改变(L→G、L→F)。DNAman软件进行氨基酸同源性分析表明,天祝白牦牛Tf基因氨基酸序列与野牦牛、牛、水牛、藏羚羊、绵羊、野猪、人、鼠、鸡和鱼Tf氨基酸序列间的同源性分别为100%、99%、96%、94%、93%、75%、69%、64%、51%、39%,说明天祝白牦牛Tf蛋白与其他物种同源,与牛类进化水平较为接近,与鸡和鱼类进化水平较远。同源建模预测Tf三级结构模型显示,天祝白牦牛Tf三级结构是在二级结构基础上经肽链折叠形成2个邻近相似的N端、C端结构域,N端结构域含N1、N2两个亚基,C端结构域含C1、C2两个亚基。结论:从天祝白牦牛肝脏组织中提取总RNA,克隆获得Tf基因编码区全长序列,并揭示了其分子遗传特性,为牦牛Tf蛋白基因工程和蛋白质功能的研究奠定了基础。