摘要：为探究如何利用CRISPR/Cas9系统靶向敲除Jurkat T细胞Kv1.3通道编码基因Kcna3,以期阐明Jurkat T细胞中Kv1.3通道介导的病理生理功能,本研究设计Kcna3第一个外显子sgRNA,将构建的pX458-sgRNA重组质粒经电穿孔方式转染Jurkat T细胞,联合使用T7EN1酶切、基因组PCR产物和TA克隆测序、Western Blot检测以及电生理、钙成像和ELISA等功能检测技术鉴定Jurkat T细胞中Kcna3敲除效果.测序结果显示,靶向Kcna3基因CRISPR/Cas9重组质粒pX458-sgRNA建立成功,设计的sgRNA2可高效切割基因组*** Blot未检测出Kv1.3蛋白表达,基因组PCR产物及TA克隆测序显示发生Indel突变.全细胞膜片钳实验结果表明,Kcna3敲除成功的Jurkat T细胞未记录到Kv1.3通道电流,钙成像技术显示Kcna3敲除Jurkat T细胞内自由Ca^2+浓度上升的幅度显著低于野生型Jurkat T细胞.ELISA实验结果显示,与野生型Jurkat T细胞相比,Kcna3敲除Jurkat T细胞IL-2水平显著下降(P<0.001).本研究成功利用CRISPR/Cas9系统靶向敲除Jurkat T细胞Kcna3,有力证明Kv1.3介导了Jurkat T细胞的免疫炎症反应,为深入研究Kv1.3通道的病理生理功能提供了新的细胞模型.

摘要：为更精准地评估交叉口范围内的驾驶风险,首先,引入驾驶员心电(EGG)数据,提出基于余弦相似性距离的逼近理想解排序(TOPSIS)模型;其次,建立滚动时间窗法,并改进传统的短期频域指标计算方法,计算模型中低频(LF)变化率指标和低频与高频之比(LF/HF)等心率变异性(HRV)指标,模型时域指标有心脏搏动周期(R-R间期)变化率和其标准差(SDNN);然后,根据心电频域和时域指标与静息状态下对应指标的接近程度进行综合排序,按照越接近驾驶风险越小的原则,评估交叉口区域的驾驶风险;最后,选择30名驾驶员,在西安市23个交叉口开展实车试验,采集试验数据并验证模型方法。结果表明:驾驶员在相同交叉口环境下的驾驶风险评估结果相似性超90.1%,所提方法可应用稀疏样本评估交叉口的整体驾驶风险;高驾驶风险的交叉口评估方差较中、低驾驶风险路口分别高38.8%和67.9%,表明低风险交叉口区域驾驶风险的评估更精准。