摘要：为了建立一种用于猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)的特异、灵敏、快速检测方法,试验根据GenBank发布的PPV基因序列保守区片段设计了一套带生物素标签的特异性引物和FITC探针,以pET28a-NS1重组质粒为阳性模板将环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术与侧向流动层析试纸(lateral flow dipstick,LFD)相结合,建立了PPV-LAMP-LFD检测方法,对LAMP-LFD的反应温度、反应时间及胶体金标记FITC-mAb比例进行优化,分析该方法的敏感性和特异性,并检测其早期临床应用效果。结果表明:建立的PPV-LAMP-LFD检测方法最适反应温度为64℃,最佳反应时间为50 min;标记1 mL胶体金需要14μg FITC-mAb;该检测方法的最低检测限为1×10 copies/μL,比琼脂糖凝胶电泳和荧光定量PCR灵敏度高19倍;对猪伪狂犬病毒(PRV)、蓝耳病病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪乙型脑炎病毒(JEV)和猪瘟病毒(CSFV)检测结果均呈阴性;早期临床应用显示可在猪感染PPV后4 h的血液中检出病毒。说明建立的PPV-LAMP-LFD检测方法具有灵敏、特异、快速、简便等优点。

摘要：为了建立一种用于猪细小病毒(PPV)7型的特异、灵敏、快速、简便检测方法,采用环介导等温扩增技术(LAMP)与侧向流动层析试纸(LFD)相结合,根据GenBank发布的PPV7保守区NS1蛋白基因序列设计1套带生物素标签的特异性引物和异硫氰酸(FITC)探针,以PPV7-pET28a重组质粒为阳性模板建立了PPV7-LAMP-LFD检测方法,对LAMP-LFD的反应温度、反应时间及胶体金标记FITC单克隆抗体(FITC-mAb)比例进行优化,分析该方法的敏感性和特异性。结果:建立的PPV7-LAMP-LFD检测方法最适反应温度为64℃,最佳反应时间为60 min;标记1 mL胶体金需要FITC-mAb量为15.6μg;该检测方法的最低检测限为1 copies/μL,其灵敏度比琼脂糖凝胶电泳和荧光定量PCR高10倍;对伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、乙型脑炎病毒、猪瘟病毒和PPV1~6型病毒检测为阴性,特异性良好;不同批次引物和探针检测结果一致,重复性好;对86份血样的诊断结果与荧光定量PCR进行比对,LAMP-LFD检测方法的阳性率为9.30%(8/86),检测灵敏度为100%(8/8),特异性为100%(78/78),2种方法的符合率为98.83%(85/86)。本研究为PPV7感染的监测与防控提供了技术支撑。

摘要：依据Gen Bank中注册的鸡马立克氏病病毒(MDV)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)、鸡痘病毒(FPV)基因组核苷酸序列中的保守序列设计引物,3种病毒各设计3对引物,共计9对引物,经生物学软件筛选后,得到3对相互匹配较佳的引物。3对匹配引物经单一PCR验证后,优化复合PCR反应条件,确定最佳的退火温度、引物浓度和Taq DNA聚合酶浓度;经特异性、敏感性试验及简化PCR试验,建立简易复合PCR检测方法。复合PCR扩增出的3条带大小与预期一致,即228 bp(MDV)、400 bp(ILTV)、499 bp(FPV);建立的复合PCR方法能同时检测出100 fg MDV、ILTV、FPV的DNA。同时依据PCR技术原理,将经典的三温热循环改进为二温热循环试验,即将退火和延伸合并为一步(62℃),缩短了反应时间。建立的3种病毒的复合PCR检测方法具有较高的特异性和敏感性,可以用于临床病料的快速诊断。

摘要：2011-2012年,河南省大面积暴发商品蛋鸡群肿瘤病,临床剖检疑似马立克氏病(Marek's disease,MD),为进一步确诊病因,根据马立克氏病病毒(Marek's disease virus,MDV)的meq、gB和pp38基因分别设计了3对特异性引物,利用PCR技术对送检的疑似病例鸡的肝脏和脾脏样品分别进行了检测和分析。结果显示,各地区随机抽取的5只病例鸡肝脏、脾脏样品中均扩增出3种不同大小的MDV特异性病毒基因PCR产物,这表明MDV在河南鸡群中广泛流行,并导致了商品蛋鸡群MD的暴发。研究结果填补了河南省MD流行病学空白,为今后MD的临床快速诊断及有效防控提供了重要参考依据。