摘要：目的：构建肿瘤坏死因子α诱导蛋白8（tumor necrosis factor alpha-induced protein 8, TNFAIP8）shRNA慢病毒表达载体,通过沉默TNFAIP8基因在小鼠巨噬细胞RAW264.7中的表达,探讨TNFAIP8基因沉默对巨噬细胞功能的影响。方法设计合成TNFAIP8的特异性shRNA序列,退火后连入pLKO.1-TRC载体构建TNFAIP8 shRNA慢病毒表达载体,双酶切和基因测序鉴定构建载体序列的正确性；转染293T细胞制备慢病毒颗粒,将慢病毒颗粒感染RAW264.7细胞,沉默TNFAIP8基因在该细胞中表达,荧光定量RT-PCR和Western blot检测TNFAIP8的基因及蛋白表达水平验证基因沉默效果。培养基因沉默的RAW264.7细胞和对照组细胞,平皿黏附试验及划痕愈合试验观察TNFAIP8沉默对 RAW264.7细胞黏附及迁移能力的影响。结果双酶切电泳结果表明,构建的shRNA慢病毒载体酶切片段相对分子质量大小正确,基因测序结果也表明插入序列正确。荧光定量RT-PCR和Western blot结果表明,基因沉默组细胞中TNFAIP8的基因及蛋白表达水平较对照组细胞均显著降低（P〈0.05）。平皿黏附试验结果发现,在接种15 min、30 min和2 h后,沉默组细胞黏附到培养皿底面上的细胞数量显著少于对照组细胞（P〈0.05）。培养12 h后,和对照组细胞相比,沉默TNFAIP8的RAW264.7细胞伪足数量较少,且突起不明显。划痕愈合试验结果表明,划痕24 h后,对照组细胞划痕面积明显缩小,划痕愈合率达到50%左右,而沉默组细胞划痕愈合率只有25%左右,显著低于对照组细胞（P〈0.05）。结论成功构建了 TNFAIP8 shRNA 慢病毒表达载体,该载体对TNFAIP8基因的表达具有良好的沉默效果；沉默TNFAIP8在小鼠巨噬细胞RAW264.7中的表达可以显著抑制巨噬细胞的黏附和迁移能力。

摘要：背景:研究人骨髓间充质干细胞定向分化为多巴胺神经元及分化后细胞的功能特征,对细胞移植治疗包括帕金森病在内的神经精神性疾病具有重要临床意义。目的:采用脑源性神经营养因子、forskolin及多巴胺联合诱导人骨髓间充质干细胞向多巴胺神经元定向分化,观察诱导产生的多巴胺神经元的结构和功能。设计:随机对照观察。单位:郑州大学及河南大学。材料:实验于2005-03/2006-09在郑州大学和河南大学实验室完成。实验用骨髓取自15名健康志愿者。脑源性神经营养因子、多巴胺、forskolin及单克隆抗体酪氨酸羟化酶为美国Sigma公司产品。方法:①通过密度梯度离心获取人骨髓中的单个核细胞,贴壁培养纯化骨髓间充质干细胞。采用50μmol/L脑源性神经营养因子,10μmol/Lforskolin和10μmol/L多巴胺联合对骨髓间充质干细胞进行诱导。②诱导2周后应用电子显微镜观察细胞超微结构;免疫细胞化学染色检测神经元烯醇化酶(NSE)和酪氨酸羟化酶(TH)的表达;采用RT-PCR检测多巴胺神经元分化过程中转录因子Nurr1,Ptx3,Lmx1b及酪氨酸羟化酶mRNA表达;同时以未诱导的细胞为对照,应用高效液相色谱检测细胞多巴胺的释放水平。主要观察指标:①细胞超微结构。②NSE和TH的表达变化。③细胞内关键转录因子及酪氨酸羟化酶mRNA变化。④细胞释放多巴胺情况。结果:①细胞超微结构:诱导2周后细胞胞浆中有大量密集的呈扁平囊状的粗面内质网及其间的一些游离核糖体以及神经微丝的形成。②NSE和TH表达的变化:免疫细胞化学染色结果表明诱导分化后NSE和TH阳性细胞的表达随诱导时间的延长逐渐增高(P<0.001)。③细胞内酪氨酸羟化酶及关键转录因子变化:RT-PCR结果显示细胞均可表达Nurr1,Ptx3,Lmx1b和酪氨酸羟化酶的mRNA。④细胞释放多巴胺情况:诱导2周后的细胞多巴胺释放水平高于未经诱导的细胞,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:脑源性神经营养因子、forskolin及多巴胺可在体外诱导人骨髓间充质干细胞向多巴胺神经元分化,并具有多巴胺神经元的结构和功能特征。

摘要：受河南大学实验课程的整合与创新研究项目的资助,针对临床医学专业的学生开设了"检测细胞凋亡"为主线,融合原来附属于生物化学、分子生物学和免疫学课程的实验课,收到了良好的实验教学效果。实践证明,学生对这种融合性、综合性系列实验特别感兴趣,这种实验教学模式,极大地激发了学生自主学习的积极性,在巩固和拓展了理论课学习内容的基拙上,培养了学生的科研素质、创新精神和动手能力。教学成果的取得,为医学基础实验课程的整合和教学方法的改革与创新提供了宝贵的经验。