摘要：为有效确定引起鸡痛风的病原,本试验建立了同时检测鸡星状病毒(CAstV)、禽肾炎病毒(ANV)和鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的多重PCR方法。针对IBV的N基因、CAstV和ANV的ORF-1b基因分别设计了3对特异性引物,通过优化退火温度等反应条件建立了多重PCR检测方法,并评估了该方法的特异性和敏感性,而后对临床痛风样本进行了检测。结果显示,多重PCR方法对3种病毒扩增产物的大小分别为1 600 bp(IBV)、794 bp(ANV)和350 bp(CAstV);该多重PCR检测禽马立克氏病毒、血清4型禽腺病毒、减蛋综合征病毒和J亚型禽白血病病毒均为阴性;病毒最低检测限IBV为1.96×10^(2) copies/μL,ANV为2.10×10^(2) copies/μL,CAstV为1.33×10^(5)copies/μL;多重PCR对临床病料的检测结果与单项PCR的检测结果一致。结果表明,本试验建立的多重PCR检测方法具有较好的特异性、敏感性和可靠性,为临床鸡痛风的诊断提供了准确、有效的技术手段。

摘要：为研究血清1型Ⅰ群禽腺病毒(FAdV-1)的Fiber-2蛋白对FAdV-1在细胞水平上的中和作用,研究根据FAdV-1亚型Fiber-2基因序列设计引物,进行Fiber-2全基因序列PCR扩增并构建重组质粒,转入BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,表达产物纯化后免疫SPF鸡制备抗血清,通过鸡LMH细胞研究Fiber-2蛋白抗血清对FAdV-1感染的中和作用。结果显示,FAdV-1 Fiber-2基因扩增产物大小为1 233 bp,构建了pCold-FAdV-1-Fiber-2重组质粒,表达的FAdV-1 Fiber-2蛋白分子量大小为105 ku;FAdV-1 Fiber-2蛋白的抗血清孵育LMH细胞后,与阳性对照组相同第4天细胞出现病变,而阴性对照组细胞均无病变。结果表明,FAdV-1 Fiber-2蛋白抗血清在体外试验中不能中和本血清型病毒的感染,FAdV-1 Fiber-2蛋白作为亚单位疫苗的研究存在风险。

摘要：为快速确定临床禽腺病毒-Ⅰ群(FAdVs)的血清型,本研究根据FAdVs的Hexon基因设计引物,对12个血清型FAdVs标准毒株进行PCR扩增,并根据扩增目的片段进行酶切位点分析和相应酶切反应研究,建立聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法。结果显示,利用该引物可同时扩增12个血清型FAdVs标准毒株,扩增片段大小为894 bp;扩增片段酶切位点分析显示,Eco130Ⅰ、Pf123Ⅱ、MluⅠ、PsyⅠ和BgⅡ为主要酶切位点,这5种酶切反应结果显示12个血清型FAdVs标准毒株可以得到不同的酶切图谱,且能区分12种血清型FAdVs;应用该酶切方法对本实验室保存的2株已知血清型的分离株进行分析,其结果与已确定的血清型一致。表明本试验建立的PCR-RFLP方法简便、特异性和区分度好,可用于12个血清型FAdVs的分型。

摘要：为确定FAdV-4、FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-11这4个血清型FAdV间存在的交叉保护是否与病毒的纤维蛋白(Fiber)有关,制备4个血清型FAdV Fiber蛋白抗血清,在细胞水平研究其对本血清型和其他3种血清型病毒感染的中和作用。针对4个血清型FAdV的Fiber基因设计引物,进行PCR扩增,构建pCold-FAdV-Fiber重组质粒,分别转入BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE和Western Blot鉴定表达产物;表达产物纯化后免疫SPF鸡,采集抗血清,通过LMH细胞研究不同血清型Fiber蛋白血清对各血清型FAdV感染的中和作用。PCR扩增结果显示,FAdV-4、FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-11 Fiber基因产物大小分别为1440,1575,1566,1719 bp;重组菌在16℃培养条件下,1.0 mmol/L的IPTG诱导24 h可溶性重组蛋白的表达量最高;SDS-PAGE和Western Blot结果显示,FAdV-4、FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-11表达的蛋白分子量大小分别为102,107,107,112 ku;中和结果显示,FAdV-4、FAdV-8b和FAdV-11 Fiber蛋白抗血清能中和自身血清型FAdV对细胞的感染,不能中和其他血清型FAdV的感染,而FAdV-8a Fiber蛋白抗血清不能中和这4种血清型中的任何一种血清型FAdV的感染。综上,Fiber蛋白与4个血清型FAdV全病毒之间存在的交叉保护无直接关系。

摘要：为快速检测禽腺病毒-Ⅰ群(FAV-I)感染,且能有效区分常见混合感染的新城疫病毒(NDV)和传染性支气管炎病毒(IBV),本研究建立了多重PCR诊断方法。根据GenBank发表的FAV-Ⅰ的Hexon基因、NDV的F基因和IBV的N基因分别设计了3对特异性引物,通过对引物浓度、退火温度等反应条件的优化建立多重PCR诊断方法,并对该方法进行了特异性和敏感性研究,且对临床样本进行检测。结果发现,本研究建立的多重PCR方法可准确扩增出大小为895 bp(FAV-I)、1600 bp(IBV)和529 bp(NDV)的特异性片段;3种引物最佳浓度分别为3 pmol/μL、3 pmol/μL和6 pmol/μL,最佳退火温度为55℃;该方法对3种病毒的最低检测限分别为1.46×10^5拷贝/μL、8.93×10^2拷贝/μL和2.11×10^4拷贝/μL;且该方法不能扩增出减蛋综合征病毒、马立克病毒、鸡传染性贫血病毒和H9亚型禽流感病毒等,临床样品检测结果与单项PCR结果相同。表明本研究建立的多重PCR检测方法具有较高的敏感性、特异性和稳定性,可有效地区分FAV-I、NDV、IBV。

摘要：为了构建和筛选抗Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)单链抗体库,试验用Ⅰ型鸭肝炎疫苗免疫樱桃谷鸭,以分离的外周血淋巴细胞总RNA为模板,根据抗体保守区序列设计引物,通过RT-PCR技术扩增出鸭IgG轻链可变区和重链可变区基因,由Linker序列连接,用重叠延伸PCR(SOR-PCR)技术将其连接成单链抗体基因,将扩增的单链抗体基因导入pComb3XSS载体中构建抗DHV-Ⅰ噬菌体单链抗体库,并对该噬菌体单链抗体库进行3次吸附-洗脱-富集。结果表明:试验成功构建出库量为8.5×109pfu/mL的抗DHV-Ⅰ噬菌体单链抗体库,筛选出1株亲和力较高的抗DHV-Ⅰ噬菌体单链抗体。说明试验成功构建了鸭源抗DHV-Ⅰ噬菌体单链抗体库,筛选出1株与DHV-Ⅰ亲和力良好的鸭源噬菌体单链抗体。