摘要：背景:目前还未找到一个理想的标记性分子用来鉴定骨髓间充质干细胞,因此也就不能保证骨髓间充质干细胞的同质性。目的:以BrdU体外示踪标记验证大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导后的分化潜能。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-01/10在山西医科大学完成。材料:4周龄Wistar大鼠由山西医科大学实验动物中心提供。方法:密度梯度离心+贴壁培养法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,达80%融合时胰蛋白酶消化传代扩增。取5×1010L-1个骨髓间充质干细胞接种于25mm培养皿,加入含地塞米松、β-磷酸甘油、维生素C和体积分数为10%胎牛血清的L-DMDM培养基进行成骨诱导。取第3代骨髓间充质干细胞,加入终浓度为10μmol/LBrdU进行体外示踪,200倍荧光显微镜下随机选取10个视野,通过计数阳性细胞与非阳性细胞数得到BrdU标记率。主要观察指标:倒置显微镜下观察细胞形态,流式细胞仪检测细胞表面抗原,观察诱导后成骨分化潜能,体外BrdU标记率。结果:分离纯化的骨髓间充质干细胞呈均一的成纤维细胞样,贴壁生长,以长梭形为主,传至第3代呈明显的同向性改变,漩涡状盘旋排列,细胞存活率均大于95%,至第7代仍未见细胞生长减缓现象;CD44,CD71,CD105均呈阳性表达,CD45呈阴性表达;成骨诱导后Vonkossa染色可见骨髓间充质干细胞中有黑色颗粒沉积;BrdU标记率>90%。结论:密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,可在体外长期培养,并具有成骨分化潜能;BrdU可成功标记骨髓间充质干细胞,是安全、有效、便捷的体外示踪方法。

摘要：背景:超顺磁性氧化铁颗粒标记成像可在体观察标记细胞移植后情况,但结合临床细胞治疗剂量,其标记浓度及标记时间对细胞标记率、标记活性及标记后成像效果的综合影响还需进一步分析。目的:筛选超顺磁性氧化铁体外标记大鼠骨髓间充质干细胞的标准化剂量,拟为体内成像提供最佳标记"浓度-时间"。设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2008-02/10在山西医科大学完成。材料:清洁级Wistar大鼠10只,由山西医科大学动物实验中心提供。Resovist中含超顺磁性氧化铁铁颗粒28g/L,为德国Schering公司产品。方法:全骨髓法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞。取Resovist,分别配制含终浓度为0,25,50,75,100,150mg/L超顺磁性氧化铁的培养基,加入P3代骨髓间充质干细胞中进行孵育标记。主要观察指标:普鲁士蓝法检测细胞标记率,锥虫蓝拒染法检测标记细胞活性,观察标记细胞体外磁共振成像情况。结果:细胞标记率达100%,随着标记时间的延长,胞质内蓝染颗粒逐渐减少。标记1d和3d时,与0mg/L超顺磁性氧化铁组比较,25,50mg/L组锥虫蓝拒染率无明显差异(F=0.28～3.15,P>0.05);与25mg/L超顺磁性氧化铁组比较,50mg/L组锥虫蓝拒染率无明显差异(F=0.28～0.79,P>0.05)。体外磁共振成像示标记3d时,标记浓度为50mg/L组的T2WI及T2*WI信号降低最明显。结论:超顺磁性氧化铁"50mg/L-3d"体外标记效率高,对细胞活性无影响,且磁共振成像信号降低最明显,为最适"浓度-时间"组合。

摘要：背景:胰岛细胞移植可改善胰岛功能,但其来源匮乏。骨髓间充质干细胞可被诱导分化成胰岛细胞,在糖尿病足、糖尿病心肌病、糖尿病神经病变中具有较强的组织修复能力。目的:观察骨髓间充质干细胞移植后在2型糖尿病模型鼠胰腺、肾脏组织中的存活及转归,及对血糖及肾脏病变的改善。设计、时间及地点:细胞学体内实验,于2008-02/07在山西医科大学生物化学与分子生物学教研室完成。材料:雄性Wistar大鼠由山西医科大学实验动物中心提供,造模使用的链脲佐菌素为Sigma公司产品。方法:取1只大鼠体外分离培养骨髓间充质干细胞,反复贴壁纯化,传至第3代行BrdU标记后用于移植。60只大鼠随机分为3组,模型对照组、细胞移植组向标准混合饲料中添加含体积分数为0.1的猪油和蛋黄高脂成分,喂养2个月后向大鼠腹腔内注射链脲佐菌素,血糖≥16.77mmol/L且维持3d稳定代表成功建立2型糖尿病模型。正常组采用标准混合饲料喂养2个月后,向大鼠腹腔内注射等容积柠檬酸缓冲液。造模成功后,细胞移植组经尾静脉注射骨髓间充质干细胞悬液0.5mL(细胞数1×106个),其余两组注射等量PBS液。主要观察指标:各组大鼠血糖浓度及三酰甘油、胰岛素水平的变化,肾组织病理学变化,细胞在肾脏及胰腺组织中的分布。结果:与移植前比较,移植后7,14,21d模型对照组血糖浓度无明显变化,细胞移植组血糖浓度明显下降(P<0.001);移植后21d与正常组比较,模型对照组及细胞移植组三酰甘油水平均显著升高(P<0.001),胰岛素水平均显著降低(P<0.001),但细胞移植组胰岛素降低幅度小于模型对照组(P<0.001)。糖原染色结果示模型对照组肾小球发生肥大,细胞移植组肾小球基质变薄,肥大得以改善。胰岛素免疫荧光染色后,模型对照组胰岛细胞明显减少,而细胞移植组胰岛细胞增加,在胰腺、肾脏组织中均可见BrdU标记的阳性细胞。结论:经尾静脉注射骨髓间充质干细胞可定位于2型糖尿病大鼠胰腺及肾脏,并对其进行组织修复,同时可降低血糖,增加胰岛素分泌。