摘要：为建立一种牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的快速检测方法,本研究根据国内BVDV流行毒株5'-UTR序列保守区域设计1对特异性引物和TaqMan探针,并优化了反应条件,最终建立了一种检测BVDV基因1型(BVDV-1)的TaqMan探针荧光RT-PCR检测方法,并开展7省份BVDV-1型检测和流行情况分析。结果显示:所建立方法能够特异性检测出BVDV-1,与基因2型BVDV、猪瘟病毒、边界病毒、牛冠状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛轮状病毒等病原无交叉反应;灵敏度高,最低检测下限为4.3 copies/μL;批内和批间变异系数均小于2%,重复性良好。7省份规模化牛养殖场BVDV-1型平均阳性率为17.40%(161/925),序列分析表明我国主要流行的为BVDV-1a,BVDV-1c亚型。本研究成功建立了一种良好的诊断BVDV的方法,监测地区优势流行毒株为BVDV-1a与1c亚型,为临床中BVDV早期诊断和流行病学调查监测提供了技术和数据支持。

摘要：为了建立一种敏感、特异的牛冠状病毒(BCoV)实时荧光定量RT-PCR检测方法,试验利用GenBank中BCoV参考毒株N基因序列,设计引物及小沟结合物(MGB)探针,建立实时荧光定量RT-PCR方法,对方法的特异性、灵敏度和稳定性进行检验。利用建立的方法对采集自7个省份31个发病牛场的925份临床样本进行检测,并用基于BCoV N基因的普通RT-PCR结合测序的方法对部分阳性样品进行验证。结果表明:建立的实时荧光定量RT-PCR方法的扩增体系为上下游引物(10μmol/L)各1μL,探针(10μmol/L)0.8μL,2×One Step RT-PCR BufferⅢ10μL,Ex Taq HS(5 U/μL)0.4μL,Prime Script RT Enzyme MixⅡ0.4μL,总RNA 2μL,ddH_(2)O 4.4μL;扩增程序为,42℃5 min;95℃10 s;95℃5 s,55℃35 s,40个循环。标准曲线方程为y=40.979-3.512x,可信度(R^(2))为0.999,扩增效率(E)为92.6%,最低检测限为48 copies/μL,重复性变异系数(CV)不超过0.82%。31个发病牛场BCoV阳性场占比为64.52%(20/31),其中腹泻症状阳性场占比为54.55%(12/22),呼吸道症状阳性场占比为65.22%(15/23);阳性样品经基于BCoV N基因的普通RT-PCR方法验证,测序正确。说明建立的BCoV实时荧光定量RT-PCR检测方法灵敏度高、特异性强、稳定性好,能检测出临床样本中的BCoV核酸,可应用于BCoV感染的诊断、监测与流行病学调查。

摘要：【目的】制备红嘴鸥Toll样受体7(Toll-like receptor 7,TLR7)蛋白多克隆抗体,分析红嘴鸥TLR7蛋白在DF-1细胞中的表达特征,为深入了解红嘴鸥TLR7蛋白功能及作用机制提供材料。【方法】设计引物扩增红嘴鸥TLR 7基因CDS区,并构建其原核表达载体与真核表达载体。将重组原核表达质粒pET32a-TLR7转化大肠杆菌Transetta(DE3)感受态细胞进行重组蛋白体外诱导表达,并对其诱导温度、诱导时间和IPTG浓度进行优化筛选。选用新西兰大白兔制备多克隆抗体,采用间接ELISA法检测血清抗体价效,利用Western blotting鉴定抗体特异性。将真核表达质粒pcDNA3.1-TLR7转染至DF-1细胞中过表达,利用间接免疫荧光技术检测红嘴鸥TLR7蛋白在转染DF-1细胞后不同时间点的表达特征。【结果】红嘴鸥TLR 7基因CDS区长约1182 bp,双酶切结果显示出2组大小不同的2条片段,分别为5900、1182 bp(原核表达载体)和5428和1182 bp(真核表达载体),测序后表明原核表达载体与真核表达载体构建成功。体外诱导温度为30℃、IPTG终浓度为1.0 mmol/L时培养5 h得到以包涵体形式大量表达的重组蛋白,蛋白大小为63 ku。间接ELISA法检测抗血清效价为1∶256000以上。Western blotting检测结果表明,制备的多克隆抗体具有较好的特异性。间接免疫荧光结果显示,转染DF-1细胞2 h后即可观察到绿色荧光,随着时间增加绿色荧光密度逐渐增加,且绿色荧光大部分聚集在细胞核及周围,少部分散布在细胞质中。【结论】原核表达的红嘴鸥TLR7蛋白具有良好的免疫原性,制备的多克隆抗体具有较高的反应性和特异性,TLR7蛋白可在DF-1细胞中成功表达。

摘要：为进一步了解我国猪流行性腹泻病毒(PEDV)的分子流行病学特征,从阳性病料中分离得到1株河南毒株(命名为HeN17-2011),设计13对引物,对分离株HeN17-2011的基因序列进行RT-PCR扩增和全基因组3′Race、5′Race扩增,通过产物回收、转化和测序,经生物软件拼接,成功获得其全基因序列,并与近十几年的流行毒株进行了序列比对分析。结果显示:分离株HeN17-2011基因组全长为28038 bp(不含polyA尾),基因组结构为5′UTR-ORF1-S-ORF3-E-M-N-3′UTR,与PEDV基因组的结构特征相符;通过与GenBank中已发表的国内外毒株ZJCZ4、CV777、DR13等26株PEDV序列进行比对发现,HeN17-2011与NW8的同源性最高为99.4%,与标准株CV777、韩国毒株DR13(JQ023161.1)和DR13(JQ023162.1)、美国毒株Illinois261、意大利毒株PEDV-1842-2016-ITA的同源性分别为96.9%,97.7%和97.3%,99.2%,98.7%,与SD-M的同源性最低为96.4%;PEDV分离株HeN17-2011与标准株CV777、韩国毒株DR13处于不同的分支上,遗传关系较远,属变异毒株,但与我国的流行毒株CH-SCZY103-2017、NW8等遗传关系较近;通过对全基因组序列分析发现,我国PEDV流行株在ORF1b、ORF3、E基因、M基因和N基因上的长度是保守的,它们虽然均存在点突变,但没有碱基的插入和缺失,我国流行株基因组长度变化主要与5′UTR、ORF1a、S基因、ORF3和3′UTR的碱基插入、缺失密切相关。

摘要：为提高电力线路的输送能力并减少能量损耗,特高压线路导线直径越来越大,重量越来越重,需要采用更高强度等级的绝缘子来减少绝缘子的使用数量,降低杆塔荷载,简化线路连接,提高安全系数。研究绝缘子双联耐张串串型的设计,从电气性能和机械性能两个方面保证串型的实用性,并在此基础上开展配套金具研究,包括碗头挂板、联塔金具和跳线间隔棒。大吨位绝缘子配套金具在参考低吨位设计标准的基础上,结合现有的设计经验,通过采用整体锻造方式加工,可有效提高组串的机械性能。试验表明所研究的配套的碗头挂板等非标金具符合国家、电力行业标准和工程技术规定,机械和电气性能试验均满足要求。

摘要：猪流行性腹泻在我国的发病率和死亡率居高不下,给养猪业造成了重大损失。为进一步了解我国猪流行性腹泻流行毒株的遗传变异规律,试验对河南、江西、福建、辽宁、浙江、湖北6个省份的19个PEDV地方流行株的S基因进行了RT-PCR扩增,并对其进行了序列比对和遗传演化分析,旨在为疫病的防治和疫苗株的选择提供参考和依据。试验设计了3对引物,对采集自6个省份13个疑似PEDV发病猪场的19份仔猪小肠及其内容物样品进行了RT-PCR扩增,通过产物回收、转化和测序,经生物软件拼接,成功获得其S基因全序列。它们的S基因全长由4 158~4 161 nt组成,其中仅JX1、JX2毒株的长度为4 158 nt,其余毒株的长度均为4 161 nt。通过与GenBank中已发表的国内外毒株CV777、DR13等61株PEDV S基因序列进行比对发现,19个毒株与经典株CV777的同源性为93.8%~94.1%,其彼此之间的同源性为97.7%~100%。基因推导的氨基酸序列分析表明,试验所获得的19株流行毒株中,仅JX1和JX2两个毒株由1 386 aa构成,而其他毒株均由1 387 aa组成,19个毒株S蛋白氨基酸与经典株CV777的同源性为92.8%~93.4%,其彼此之间的同源性为97.7%~99.9%,且均存在点突变、氨基酸插入和缺失现象。S基因进化树分析表明,PEDV毒株被分成了2个大群,试验获得的19个毒株均处于G1群中,但与我国其他分离株处于G1大群中的不同分支中,且与处在G2群中的经典株CV777、韩国弱毒株DR13和日本弱毒株83P-5等毒株的亲缘关系较远。说明PEDV S基因一直处于变异进化过程中。

摘要：针对伪狂犬病病毒疫苗株基因组缺失的3.5kb片段,设计3套引物和探针,并用标准的伪狂犬病病毒野毒株和疫苗毒株进行测试,建立了一种新的快速鉴别伪狂犬病病毒野毒株和疫苗株的实时荧光定量PCR方法。该方法的检测极限可达10copies/μL,并与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒等不存在交叉反应现象,批内和批间重复性试验的变异系数分别为1.70%±1.07%和2.22%±1.02%,显示该方法具有良好的重复性。在对临床20份样品的检测时,该荧光定量PCR的阳性率为60%,普通PCR的阳性率仅为40%。结果表明,该方法具有特异性高、敏感性强的特点,是一种值得推广的快速诊断技术,可用于猪伪狂犬病的诊断和流行病学调查等。

摘要：依据Genbank中传染性支气管炎病毒N基因序列,设计引物采用PCR方法从本实验室分离到的病毒株中扩增获得约1 230bp的N基因,并将N基因片段克隆插入pMD18-T载体获得pMD18-T-N;采用酶切(Eco RI、XhoI)的方法从已构建的T克隆质粒pMD18-T-N上获得IBVN基因片段,将其亚克隆插入原核表达载体pET32a,成功构建重组原核表达质粒pET32a-N。将重组质粒转入BL21(DE3)细胞,经IPTG诱导表达,可稳定、高效地表达N蛋白。SDS-PAGE结果表明,以终浓度为1mmol/mL的IPTG在37℃进行诱导,5h后表达量最高。这一原核表达载体pET32a-N的构建为进一步研究核酸疫苗奠定了前期基础。

摘要：从新疆维吾尔自治区石河子地区某猪场采集了150份猪脑组织样品,利用RT-PCR方法进行流行性乙型脑炎病毒(JEV)NS1基因扩增,结果有32份组织样品扩增出了430 bp的特异性目的条带。用检测的阳性样品研磨液接种乳鼠进行JEV的分离,经3次乳鼠传代后获得了1株JEV,命名为XJ/08/01。在此基础上,设计引物从接毒乳鼠脑组织样品中扩增JEV的主要抗原基因PrM/E并进行序列分析,结果表明,该分离毒株与JEV疫苗株SA14-14-2的同源性为99.6%,根据基因分型法确定该分离株属于基因Ⅲ型JEV。

摘要：新疆南部沙尘天气比较常见,鞋子容易变脏,需要经常洗刷。针对现有洗鞋机存在的耗时、耗水、鞋子损伤较大等问题,设计一种夹持式的小型洗鞋机。该机器具有夹持和清洗两大功能。采用伸缩鞋模机构+插拔式鞋架夹持鞋子,通过齿轮机构实现对滚式毛刷机构的反向、差速转动。清洗分为两步进行,第一步采用高压水泵,通过管路喷射高压水流进行清洗,去除鞋子表面大颗粒污物。第二步,启动电机后,动力通过齿轮机构驱动毛刷旋转,转向相反、转速不同的一组毛刷分别对鞋子两侧面进行洗刷,球销副机构可以保证鞋子在不同的转向下进行往复摆动,实现无死角、全方位清洗。由于鞋子固定放置,避免鞋子直接碰撞产生的损伤,利于延长使用寿命。