摘要：建立柑橘溃疡病菌的普通LAMP和快速LAMP检测方法,使其能应用于基层检验检疫部门对病害的快速检测。利用柑橘溃疡病菌基因组特有的保守区域设计LAMP引物,通过优化反应条件,建立柑橘溃疡病菌的普通LAMP检测体系;在普通LAMP引物的基础上设计一对环引物,建立柑橘溃疡病菌的快速LAMP检测体系,并以多种参比菌DNA以及健康柑橘叶片基因组DNA为模板对普通LAMP和快速LAMP检测体系的特异性进行了验证,利用柑橘溃疡病菌菌液和DNA溶液梯度稀释液对普通LAMP和快速LAMP检测体系的灵敏度进行了验证。普通LAMP检测体系菌体和DNA检测灵敏度分别达到了2.25×104cfu和2.03×10-1 ng,快速LAMP检测体系菌体和DNA检测灵敏度分别达到了2.25cfu和2.03×10-5 ng。在特异性测试中,普通LAMP检测体系与快速LAMP检测体系均仅对柑橘溃疡病菌进行扩增,对非靶标菌和柑橘叶片基因组DNA不产生扩增,普通LAMP与快速LAMP检测体系特异性测试结果一致。快速LAMP检测体系在0.5h内就可以达到普通LAMP检测体系的扩增量,是普通LAMP检测体系反应时间的一半,大大提高了检测的效率;快速LAMP检测体系菌悬液和DNA检测灵敏度均比普通LAMP检测体系提高了10 000倍。成功地建立了柑橘溃疡病菌的普通LAMP及快速LAMP检测方法,为柑橘溃疡病菌的检测提供了一种新的简便、快速的检测手段。

摘要：根据病毒外壳蛋白区序列设计PVX、PVS特异性引物对 ,根据P1基因区序列设计PVA特异性引物对 ,应用三重RT PCR同步检测马铃薯X病毒 ,马铃薯A病毒及马铃薯S病毒 ,分别得到 5 62bp、 2 5 5bp、 1 82bp大小的扩增片段。试验从反转录反应、PCR反应及循环条件 3方面讨论了试剂和循环条件对三重RT PCR同步检测 3种病毒的影响。结果表明反转录反应中dNTPs浓度、 3种病毒下游引物浓度比例对整个反应影响较大 ;其次是PCR反应中MgCl2 浓度和退火温度 ;反转录时间 ,循环条件对RT PCR影响较小。

摘要：环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术是利用2对特殊设计的引物和一种具有链置换活性的DNA聚合酶,在恒温条件下特异、高效地扩增DNA的新技术,扩增产物为一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段混合物,电泳图谱呈阶梯式带状分布,反应伴有白色的副产物焦磷酸镁沉淀产生,可通过肉眼定性判断反应结果。LAMP技术已在核酸的科学研究、疾病诊断和动物胚胎性别的鉴定等领域得到了广泛的应用。从LAMP技术的原理、引物组成及反应过程、技术特点、方法延伸和应用等方面对其进行了概述,以期为同类研究提供参考。

摘要：唐菖蒲伯克霍尔德菌洋葱致病型(Burkholderia gladioli ***),是重要的植物病原细菌检疫性有害生物。本研究的目的是建立特异、灵敏、快速的TaqMan探针荧光定量PCR方法用于检测洋葱腐烂病菌(*** ***)。利用洋葱腐烂病菌保守基因序列设计和筛选特异性引物和TaqMan探针,优化PCR反应体系和反应条件。荧光定量PCR菌液检测灵敏度达到1.02×102CFU/mL,DNA检测灵敏度达到1.73×10-4ng/μL,反应时间仅需1h左右,对14种伯克氏菌属(Burkholderia)参比菌种的特异性检测结果显示,洋葱腐烂病菌具有明显的扩增曲线生长,表明建立的荧光定量PCR体系具有非常高的特异性。同时对洋葱(Allium cepa)种子进行了模拟带菌检测,结果表明,建立的洋葱腐烂病菌荧光定量PCR检测体系能够检出模拟样品中的洋葱腐烂病菌,验证了检测体系的实用性。本研究建立的洋葱腐烂病菌荧光定量PCR检测体系能够有效用于洋葱腐烂病菌的鉴定,为进出口口岸和基层检验检疫部门提供了一种简便、快速、准确的洋葱腐烂病菌分子检测手段。

摘要：传统PCR方法不能诊断柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri *** Gabriel)的死活状态,往往导致假阳性检测结果。本研究将特异性核酸染料叠氮溴化乙锭(ethidium monoazide bromide,EMA)与PCR技术结合,旨在建立柑橘溃疡病活菌的快速检测技术。根据柑橘溃疡病菌独有的保守蛋白基因设计特异性引物扩增出278bp的靶带,PCR反应的检测下限为25个细胞/25μL或2.75pg/25μL。EMA-PCR结果表明:当卤钨灯曝光时间1min,EMA终浓度为1.0mg/L时,能有效抑制1.0×108 cfu/mL死菌的扩增;当EMA的浓度小于30mg/L时,EMA对上述相同浓度活菌靶基因的扩增没有明显的抑制。EMA-PCR对死活混合菌的扩增表明,活菌数在6.875×101～6.875×105 cfu/PCR范围时,荧光强度与混合体系中活菌的对数值有线性关系。基于以上建立的EMA-PCR活体检测技术,对疑似带病柑橘材料进行检测,结果发现能降低柑橘溃疡病菌检测过程中的假阳性,有望为柑橘溃疡病的检疫检验提供更科学的技术手段。

摘要：根据中性海藻糖酶NTL基因的同源序列设计引物,PCR扩增出杀蝗专一菌株———金龟子绿僵菌CQMa102NTL基因片段,利用5′_RACE和3′_RACE扩增出NTLcDNA的5′和3′端序列,经拼接得到CQMa102NTL基因cDNA全长。根据其全长cDNA序列,设计引物PCR扩增出CQMa102NTL的完整基因。为了解该基因的上游调控信息,采用PanhandlePolymeraseChainReactionAmplification方法扩增其上游序列。序列分析表明,CQMa102NTL全长DNA3484bp,cDNA全长2385bp,编码737个氨基酸的蛋白,推测蛋白分子量为83.1kD;含有3个内含子,包含一个依赖于cAMP的磷酸化作用位点(RRGS)和一个钙附着位点(DTDGNMQITIED);上游序列含有一个压力反应元件(CCCCT);与金龟子绿僵菌广谱性菌株ME1NTL的核苷酸序列和氨基酸序列分别具有93%和99%同源性,由此确定该序列为金龟子绿僵菌中性海藻糖酶基因序列。Southern杂交表明,NTL基因在CQMa102基因组中为单拷贝。Northern杂交表明,NTL基因转录出约2.5kb的mRNA单带,在液体培养条件下,对数生长前期表达水平最高,对数生长后期降到最低,进入稳定生长期后表达水平又有所提高。金龟子绿僵菌CQMa102中性海藻糖酶基因DNA全长和cDNA全长登录GenBank,登录号分别为:AY557613,AY557612。

摘要：根据地毯草黄单孢Xac306菌株（Xanthomonas axonopodis ***，Xac 306）已知全基因组中独有蛋白基因序列设计的特异性引物对和探针，建立并优化SYBR Green I（SGI）荧光染料和TaqMan探针实时荧光定量PCR检测体系，用于柑桔溃疡病早期诊断鉴定。结果表明，建立的两种定量PCR体系均能特异地检出Xac的细胞和其基因组DNA，而对其它测试的植物病原菌和柑桔表面的腐生黄单孢菌都不能检出。SGI法和TaqMan探针法对Xac细菌悬浮液的检测灵敏度均可达到1～5个细菌／反应，对Xac靶标片段DNA的检测灵敏度可达1fg／μL。两种定量PCR检测方法比常规PCR灵敏度高2～3个数量级。对田间采集的328个柑桔显症、疑似症状和无症带菌材料富集培养样品进行了实际检测，结果表明，实时荧光PCR适合柑桔无症带菌样品的早期检测。

摘要：建立了松材线虫PCR检测标准化阳性对照及特异性强的PCR检测体系.根据松材线虫rDNA-ITS区和BxPe12基因的特异基因序列设计引物,并从中筛选出一对特异引物cqubs01/cquba01,该引物能从松材线虫特异性扩增出196bp片段,而不能对其他种类线虫进行扩增.基于优化PCR反应体系和反应程序,稳定的检测体系得以建立,检测灵敏度为100pg/μL.以松材线虫基因组DNA为模板,以上述特异引物进行PCR扩增,将纯化后的PCR产物与PMD18-T载体连接之后转入大肠杆菌中,筛选出阳性克隆进行测序验证,最终获得了松材线虫的无害化阳性对照,建立了松材线虫标准化阳性对照的PCR检测体系.对来自于不同地区的12批次近100个样品进行了实际检测验证,其结果与实际发生情况一致,说明本检测体系稳定可靠.

摘要：基于马铃薯病毒ssRNA的快速制备方法,根据马铃薯病毒CP基因序列设计PVX、PVS、PVY和PLRV特异性引物对、P1基因序列设计PVA特异性引物对,建立了多重RT-PCR快速检测体系,可以同步检出复合侵染马铃薯种苗主要病毒,灵敏度比传统的ELISA至少高100倍.结合生物活性稳定剂研制的固相化检测试剂盒,已用于四川和重庆等省区的15个县市田间与苗圃248个马铃薯显症或无症样品的实际检测,表明四川和重庆地区2～3种马铃薯病毒往往复合侵染(PVX、PVA和PVS三种病毒复合侵染或PLRV和PVY二种病毒复合侵染).

摘要：柑桔溃疡病是严重影响全世界柑桔生产的重大检疫性病害,根据柑桔溃疡病菌(Xanthomonas axonopodis ***)新近公布的全基因组中独有的保守蛋白基因序列,设计筛选出一对种特异性引物(JYF5/JYR5),能专一地扩增检出柑桔组织表面所带溃疡病菌的DNA靶带(413 bp)。而柑桔叶面附生的非致病性黄单胞菌、野油菜黄单胞菌近缘种以及健康柑桔样品都不能扩增;靶细菌DNA检测下限1.56 pg/μL,靶细菌悬浮液检测下限10 cfu/μL;在不同PCR仪及各种控温方式下都能稳定地扩增出特征性靶带。这一特异、准确的柑桔溃疡病菌PCR检验技术和研制的预包被固相化PCR检测试剂盒已开始用于我国非疫生产区建设中柑桔苗木、果实的病害检疫检验。