摘要：提取人工分离、培养的中华绒螯蟹颤抖病病原螺原体的基因组DNA,并进行梯度稀释作为PCR模板,根据GenBank已有螺原体16S rRNA基因序列设计出套式PCR外部引物,将螺原体特异性引物作为内部引物,利用套式PCR对梯度稀释的模板进行扩增,得到271 bp产物,对照已有的一步PCR检测法,检测灵敏度提高100倍,最小检测达15.5 fg数量级螺原体DNA,从而建立更为灵敏的中华绒螯蟹颤抖病病原螺原体的检测方法。

摘要：基于副溶血弧菌gyrB基因保守序列设计1对特异性引物,建立SYBR GreenⅠ实时定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测副溶血弧菌的方法。SYBR GreenⅠ实时定量PCR的Tm为90℃,扩增产物的熔解曲线只出现1个单特异峰,无引物二聚体,表明该引物具有较好的特异性;所制作的实时定量PCR扩增标准曲线在2.06×108～2.06×103拷贝数之间有较好的线性关系,相关系数为0.992,能对副溶血弧进行准确的定量分析。该方法检测时间从核酸抽提到结果分析仅需4～5h,且较传统方法敏感、操作简单,可用于针对副溶血弧菌的进出口检验检疫、食品安全检测及该菌引起的水产动物疾病的诊断与分子流行病学调查。

摘要：选择lolB和toxR两种基因序列设计2对特异性引物,建立一种针对霍乱弧菌所有生物型菌株的双重PCR检测方法,扩增目的片段大小分别为519bp和779bp。结果表明:在同步扩增中,仅霍乱弧菌模板可同时扩增出2种基因片段,4株对照菌模板无任何扩增条带;敏感性检测结果显示,该双重PCR最低能检测3.42×103CFU/mL菌落数的霍乱弧菌。所建立的基于lolB和toxR两种基因的双重PCR检测方法特异性强、敏感性高、方法简单、用时短,可用于霍乱弧菌检测。

摘要：取体表出血、肌肉溃疡的虾蟹养殖塘混养大量死亡的矛尾复鰕虎鱼的深层溃烂组织及肝脏进行细菌分离,2种被检组织中均分离到2种优势生长菌落;人工感染试验表明,其中的一株分离菌(S090801)浓度为106～108 cfu/ml可引起矛尾复鰕虎鱼全部死亡,该菌的形态特征、生理生化特性及基于16SrRNA和gyrB 2种基因的系统发育学分析确定为弧菌属的哈氏弧菌。同时基于gyrB基因序列设计1对特异性引物,建立了一种哈氏弧菌快速、敏感的PCR检测方法,扩增目的片段大小为363bp,该方法检测哈氏弧菌模板DNA最低质量浓度为0.046875ng/μl,可用于哈氏弧菌引起的水产动物疾病的快速诊断及分子流行病学的调查研究。

摘要：基于toxR基因序列设计检测哈氏弧菌的1对特异性引物,通过PCR反应条件优化、PCR反应特异性及敏感性检测,建立一种哈氏弧菌的特异性分子检测方法。试验结果表明,该引物可使哈氏弧菌扩增出大小为390 bp的toxR基因片段,3种水产动物病原弧菌未扩增出任何条带,敏感性检测结果为该PCR反应最低能检测出0.375 ng/μl的哈氏弧菌基因组DNA。该试验建立的基于toxR基因的哈氏弧菌的PCR检测方法可用于哈氏弧菌引起的水产动物疾病的快速诊断及海产品安全检测。

摘要：采用常规表观生物学特性及16S rRNA、gyrB及rpoA基因同源性检索与系统发育学分析等方法,对分离自江苏连云港某育苗场的大批死亡日本对虾蚤状幼体的优势生长菌进行了综合鉴定。结果表明,其形态和生理生化特征与弧菌属的需钠弧菌相近;16S rRNA、gyrB及rpoA基因同源性检索也均与需钠弧菌相似性最高,分别为98%、89%和95%,且三种基因的NJ系统发育树也均与需钠弧菌聚为一个分支;分离菌的致病性试验表明其半数致死量LD50为1.8×106CFU/ml。综合分离菌的致病性、形态与生理生化特征及基因同源性与系统发育分析结果,认为引起日本对虾蚤状幼体大批死亡的病原为需钠弧菌。基于gyrB基因序列设计1套LAMP特异性引物,建立了需钠弧菌的快速特异性检测方法,可用于由需钠弧菌引起的水产动物疾病的诊断及分子流行病学的调查研究。

摘要：本研究选择副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的toxR和霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的rtxA基因序列设计2对特异性引物,建立了在同一反应体系中同步检测2种病原菌的双重PCR检测方法,扩增目的片段大小分别为368bp和417bp。特异性试验结果表明,在同一反应体系下,副溶血弧菌和霍乱弧菌扩增出目的条带,其他4种对照病原细菌无任何扩增条带;单一及双重PCR敏感性试验结果表明,稀释浓度在(109～102)CFU/mL,单一PCR与双重PCR均可扩增出目的条带,且单一PCR与双重PCR表现出了相同的灵敏度(102 CFU/mL),表明本实验优化的双重PCR反应条件良好;人工染菌样品均可扩增出两条目的条带,表明该方法可直接用于针对病原副溶血弧菌和霍乱弧菌感染的水生动物疾病的检测以及水产品的安全检测,在水产品致病菌的风险评估和大规模样本的分析检测领域具有较高的潜在应用价值。

摘要：基于副溶血弧菌toxR基因保守序列设计1对特异性引物,建立了SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测副溶血弧菌的方法。常规PCR检测,副溶血弧菌扩增出大小为368bp的目的片段,其他4种病原细菌均为阴性;SYBRGreenⅠ实时定量PCR扩增曲线反映了PCR的指数增长阶段和平台阶段;在Tm为85℃,扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体;所制作的标准曲线在2.7×108～2.7×102拷贝数之间有较好的线性关系,相关系数为0.998,能对副溶血弧菌进行准确的定量分析;该方法检测时间从核酸抽提到结果分析仅需4～5h,较传统方法敏感、操作简单,耗时短,是副溶血弧菌引起的水产动物疾病的快速诊断及食品中针对副溶血弧菌安全检测的有效手段。

摘要：采用分子生物学方法,以霍乱弧菌lolB为靶基因设计特异性引物,进行了霍乱弧菌的PCR和环介导等温核酸扩增(Loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)检测技术研究,并对它们的特异性、灵敏性和实际应用进行了比较。结果表明,所建立的PCR检测霍乱弧菌的方法最低检测限为4.0×103CFU/ml;LAMP检测方法在65℃下恒温扩增60min,检测限为4.0×101CFU/ml,反应产物加入荧光染料SYBRGreenI后反应液呈现明显的绿色;以温和气单胞菌、副溶血弧菌、鳗弧菌及美人鱼弧菌为对照菌株,检测结果均为阴性;霍乱弧菌人工染菌的8种水产品进行PCR及LAMP检测,结果均为阳性,而未染菌组均为阴性;PCR及LAMP检测霍乱弧菌的方法均具有灵敏度较高、特异性强等优点,且LAMP检测霍乱弧菌的方法灵敏度是PCR方法的100倍,更适合于养殖现场检测的推广使用。

摘要：基于霍乱弧菌lolB基因保守序列设计1对特异性引物,建立了SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测霍乱弧菌的方法。常规PCR检测仅霍乱弧菌扩增出大小为519bp的目的片段,其他3种病原弧菌均为阴性;SYBR GreenⅠ实时定量PCR,在Tm为86.5～87℃,扩增产物的熔解曲线只出现1个单特异峰,无引物二聚体,表明该引物具有较好的特异性。SYBR GreenⅠ实时定量PCR扩增曲线反映了PCR的指数增长阶段和平台阶段;所制作的标准曲线在2.59×108～2.59×100拷贝数之间有较好的线性关系,相关系数为0.993,能对霍乱弧菌进行准确的定量分析。该方法检测时间从核酸抽提到结果分析仅需4～5h,较传统方法敏感、操作简单、耗时短,是霍乱弧菌引起的水产动物疾病的快速诊断及流行病调查的有效方法。