摘要：本文旨在研究猪睾丸ACE启动子驱动的SPAG6 shRNA在猪睾丸支持细胞(ST)中的干扰作用。利用PCR法从ST细胞基因组中扩增猪睾丸ACE启动子,构建重组质粒ACE-pIRES2-DsRed、ACE-pGL3-basic,通过红色荧光蛋白表达和双荧光素酶报告基因检测试验检测猪睾丸ACE启动子在ST细胞中的转录活性;根据SPAG6 mRNA靶序列设计合成3条siRNA序列,通过脂质体转染至ST细胞,利用实时荧光定量PCR及Western Blot检测siRNA的干扰效率;基于人miR-30a结构设计SPAG6 shRNA,构建重组载体ACE-sh-SPAG6-pcDNA3.1,Western Blot检测其对SPAG6的干扰效果。结果表明,成功构建重组质粒ACEpIRES2-DsRed、ACE-pGL3-basic,并证明猪睾丸ACE启动子在ST细胞中具有较强的转录活性;各试验组均能对靶基因SPAG6 mRNA的表达产生抑制作用,以siRNA-3的作用最佳。siRNA-3转染48 h后,SPAG6蛋白表达量显著下降(P<0.001),成功筛选出SPAG6基因的最佳干扰序列;成功构建重组质粒ACE-shSPAG6-pcDNA3.1,转染ST细胞48h后SPAG6蛋白表达量较阴性对照组显著下调(P<0.001)。本研究成功构建了猪睾丸ACE启动子驱动的SPAG6 shRNA真核表达载体,并在ST细胞中验证了其具有较好的干扰效果。

摘要：【目的】利用单碱基编辑器在宁乡花猪肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因第2外显子处引入终止密码子,以获得MSTN基因表达沉默的肾成纤维细胞系,为后期培育MSTN碱基编辑猪奠定基础。【方法】首先在MSTN基因的第2外显子处设计1条单向导RNA(single guide RNA,sgRNA),将其连接至pMLM3636-puro质粒,形成重组表达载体pMLM3636-puro-MSTN,与含有红色荧光碱基编辑器YE1-BE3-FNLS共转入宁乡花猪肾成纤维细胞中,在红色荧光和嘌呤霉素双筛选条件下,挑取单克隆细胞,测序验证后,分析阳性单克隆细胞的蛋白表达情况。【结果】在MSTN基因第2外显子处发生了碱基定点突变,目标位点的氨基酸序列由色氨酸(TGG)转变成终止密码子(TAA),且G→A突变率为5.5%。Western blotting检测结果表明,试验组10号单克隆细胞的MSTN蛋白表达量与野生型相比降低了60%。【结论】本研究运用单碱基编辑技术在宁乡花猪MSTN基因编码区引入终止密码子,使翻译提前终止,导致蛋白表达量显著降低,为后期MSTN基因碱基编辑猪的生产奠定基础。

摘要：猪传统育种周期长、耗资大,亟需利用新技术振兴种业。近年来兴起的CRISPR/Cas9基因编辑技术在猪遗传改良上表现出巨大潜力,成为研究的热点。单碱基编辑是在CRISPR/Cas9系统基础上发展起来的新型碱基编辑技术,可对单个碱基进行靶向突变。CRISPR/Cas9技术容易操作且设计简单,但该技术会导致DNA双链断裂,使基因结构不稳定,造成基因的随机插入和缺失,故而大大制约了该技术的应用。与CRISPR/Cas9技术不同,单碱基编辑技术不产生双链断裂,因而具有更高的基因编辑精准性和安全性,预期在猪遗传育种应用上具有显著优势。本文综述了CRISPR/Cas9技术的工作原理与不足、单碱基编辑的开发与优势、不同碱基编辑器的原理、应用特点及其在猪遗传改良上的应用,以期对后续开展猪的基因编辑遗传育种实践提供理论参考。

摘要：本实验在验证PPP1CC基因在猪睾丸支持细胞ST内源性表达的基础上,针对PPP1CC mRNA靶序列设计并化学合成3段不同的siRNA序列,脂质体瞬时转染ST细胞,通过实时荧光定量PCR及Western blot检测siRNA对ST细胞中PPP1CC的干扰效率。结果显示,转染24 h后,各实验组中PPP1CC mRNA表达量均显著低于阴性对照组,其中siRNA-1效果最佳。siRNA-1转染72 h后,PPP1CC蛋白表达量显著下降。本实验成功筛选出PPP1CC基因的有效干扰序列,为后续研究提供实验依据。

摘要：本试验旨在通过CRISPR/Cas9体外酶切法检测猪生长抑素(SST)基因定点修饰靶点的活性。试验设计5个长20bp的单链导向RNA(sgRNA),即SST-sgRNA-g1、SST-sgRNA-g2、SST-sgRNA-g3、SST-sgRNA-g4和SST-sgRNA-g5。化学合成sgRNA寡核苷酸序列,将寡核苷酸序列连接到可同时表达Cas9和sgRNA的质粒中,挑选正确克隆的质粒作为模板进行体外转录形成SST-sgRNA。利用CRISPR/Cas9体外酶切含靶点的DNA片段,根据酶切条带的灰度换算成sgRNA活性。结果显示目的sgRNA寡核苷酸双链成功插入到质粒中且序列正确,以质粒为模板体外转录SST-sgRNA成功。靶位点经Cas9蛋白酶切后与标准sgRNA1和sgRNA2酶切活性作比较,确定靶点SST-sgRNA-g1、SST-sgRNA-g4和SST-sgRNA-g5活性较高,可为在细胞水平、胚胎水平做基因定点修饰提供依据。

摘要：从转基因动物研究的目的出发,探讨转基因动物研究的不同思路,分析使用各种载体所考虑的基本出发点,说明受体动物遴选所需要考虑的因素,总结了转基因方法的技术特点,提出转基因动物检测手段的设计原则,论述了转基因动物繁殖的必要性,为从事转基因动物方面的研究提供技术思路。

摘要：单胚胎基因突变检测技术是以单个胚胎的裂解产物为模板进行DNA或RNA分析的方法,该技术的建立将为在单细胞水平进行基因表达和突变检测提供简便而快捷的方法。本研究设计了2对巢式引物,以显微注射了Cas9mRNA和猪SS基因2个靶点的gRNA的四细胞期孤雌胚胎为试验材料,通过蛋白酶K对猪单个胚胎进行裂解后直接进行巢式PCR分型,并检测到猪胚胎中SS基因的删除突变。该方法可以最大限度减少假阴性和假阳性结果的出现,在猪基因突变检测中具有重要作用。

摘要：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术制备了SST基因敲除的细胞。在猪SST基因第一外显子区域设计2个向导RNA(sgRNA),用PX459构建成表达质粒,电转染猪胎儿的成纤维细胞,在48 h后用嘌呤霉素筛选细胞。通过PCR扩增、测序检测,在获得的13个克隆中,有2株细胞未检测到基因敲除,4株细胞发生单等位基因敲除,7株细胞为双等位基因删除。筛选到的纯合子单克隆细胞可用于制备SST基因删除猪。

摘要：肌抑素是肌肉增生的负调控因子,为改良家畜产肉性状的重要候选基因。本研究设计了Cas9/sgRNA表达载体与供体DNA,通过电转染方法将其导入猪PK15细胞,经G418抗性筛选和荧光蛋白标记甄别,筛选到带阳性标记的细胞克隆。通过跨界PCR、长距离PCR、Western印迹、Southern印迹及PCR产物测序,证明了猪肌抑素的第3外显子序列特异性同源重组事件的发生。在猪肌抑素的第3外显子区域找到了1个有效的CRISPR/Cas9打靶位点,带阳性标记的细胞克隆经过多次筛选分离,获得了肌抑素单等位基因失活的稳定细胞系,为深入研究肌抑素的功能提供了重要的实验材料。