摘要：目的建立SYBR Green I实时荧光定量RT—PCR（FQ—RT—PCR）检测肝组织中早期B细胞因子3（early B—cell factor 3，EBF3）mRNA含量的方法，探讨EBF3 mRNA在肝癌中的检测意义。方法在EBF3基因第8和第9外显子区，在内参β2M第1和第2外显子区设计特异性引物，实时检测PCR产物的荧光强度，以各自标准品建立标准曲线，由软件自动计算出待测样本中EBF3及β2M mRNA含量，以EBF3 mRNA和β2M mRNA含量的比值进行EBF3 mRNA表达水平评价。结果FQ—RT—PCR检测EBF3 mRNA含量线性范围为3．08×10^7～3．08×10^12 copies／L，批内和批阅变异系数分别为8．6％和13．7％。18例肝癌和配对远端肝组织中EBF3 mRNA与β2M mRNA的对数比值分别为0．52±0．17和0．28±0．23，差异有统计学意义0=3．56，P=0．0011）。结论FQ—RT—PCR检测EBF3 mRNA含量的方法具有较好的检测灵敏度和重复性，适用于临床研究。

摘要：目的探讨依据寡核苷酸等位基因特异性聚合酶链反应(PCR)扩增及连接酶检测反应(LDR)方法检测乙型肝炎病毒(HBV)4种核苷(酸)类似物耐药突变的可行性。方法以基因库公布的981条HBV基因序列为基础,针对拉米夫啶、替比夫啶、阿德福韦和恩替卡韦8个耐药位点上的氨基酸替换形式,设计15对特异性引物,采用多重PCR扩增HBV P基因区野生型和突变型目的片段,然后进行多重LDR,最后在ABI3130测序仪上电泳,根据内参标记、LDR产物的长度进行结果判读。应用此方法对12例慢性HBV感染患者血清进行检测,同时采用荧光PCR、焦磷酸测序技术对其验证,判断其特异性和准确性。结果 LDR法能有效区分包括rtL180M、YMDD、YIDD、YVDD、rtA181V/T、rtN236T、rtT184G、rtS202I、rtM250V野生株和部分突变株;4例HBV DNA>106copy/mL患者检测出野生株和突变株,结果与焦磷酸测序一致;LDR法与荧光PCR法检测结果一致率达83.3%(10/12)。结论血清HBV DNA>106 copy/mL时结合多重PCR的复合LDR可通过一次扩增检测产物中的多个单突变或野生型位点,有助于核苷(酸)类似物耐药的诊断和治疗。

摘要：目的探讨连接酶检测反应(LDR)方法同时检测HBV P基因区野生型和突变型片段的可行性。方法针对拉米夫定、替比夫定、阿德福韦和恩替卡韦8个耐药位点上的氨基酸替换形式,设计15对特异性引物,采用多重PCR扩增HBV P基因区野生型和突变型目的片段,然后进行多重LDR,最后在ABI3130测序仪上电泳,根据内参标记、LDR产物的长度进行结果判读。应用此方法对12例慢性HBV感染患者血清进行检测,焦磷酸测序技术对其验证,判断其特异性和准确性。结果 LDR法能有效区分包括rtL180M、YMDD、YIDD、YVDD、rtA181V/T、rtN236T、rtT184G、rtS202I、rtM250V野生株和部分突变株;4例HBVDNA大于106copies/ml患者检测出野生株和突变株,结果与焦磷酸测序一致。结论血清HBVDNA大于106copies/ml时结合多重PCR的复合LDR可通过一次扩增检测产物中的多个单突变或野生型位点,有助于核苷(酸)类似物耐药的诊断和治疗。