摘要：根据常见支原体23S rRNA的保守区域基因序列,设计通用引物,应用SYBR Green Real Time PCR技术,研究建立了细胞培养物中支原体污染的快速检测方法。该方法能检测到污染细胞培养物的6种常见的支原体,敏感度达4.2×10-2pg/mL模式株的DNA。

摘要：根据布鲁菌BCSP31基因序列设计布鲁菌通用检测引物和探针,建立了布鲁菌Cycling探针荧光定量PCR检测方法。以构建的含BCSP31基因的质粒标准品10倍递进稀释为模板检测其敏感性,结果显示,本方法能检测约10个拷贝的阳性质粒,且标准曲线的线性关系良好。用本方法检测5株不同种的布鲁菌以及猪大肠杆菌K99、巴氏杆菌C48-1、猪链球菌ST171、绿脓杆菌等4株对照菌。结果显示,5株不同种的布鲁菌均出现典型的"S"型扩增曲线,4株对照菌40个循环内均无CT值出现。用本方法和B4/B5-PCR方法对来自布鲁菌病流行地区3个不同牛场的40份血样、奶样和血清样进行平行检测。结果显示,本方法和B4/B5-PCR方法的结果符合率为80.0%。B4/B5-PCR检测为阳性的27份样品经本方法检测均为阳性;B4/B5-PCR检测为阴性的13份样本,经本方法检测,其中8份呈阳性,5份为阴性。本方法的敏感性明显高于B4/B5-PCR方法。试验表明,所建立的Cycling探针荧光定量PCR方法具有敏感、特异、稳定等特点,可用于布鲁菌感染的快速检测。

摘要：参照GenBank中布氏杆菌的全基因组序列,设计一对特异性引物,通过PCR方法,扩增了8株来自3个布氏杆菌种的布氏杆菌表面蛋白31(BCSP31)全基因。PCR产物经克隆和序列分析后发现,该基因非常保守,8株不同菌株间的同源性高于99.3%;进化关系分析显示,5株中国来源的菌株(S2,M5,M111,M28,A387)显示了最近的同源关系,其中2个弱毒菌株S2和M5的BCSP31基因序列100%同源。3株外国来源的菌株(S19,2308,Rev.1)中,S19和2308同源性为100%。Rev.1与其他7株布氏杆菌BCSP31基因均有较大的差异。序列分析结果表明,BCSP31基因序列差异与布氏杆菌的种属和毒力无相关性。

摘要：应用环介导等温扩增(LAMP)技术建立了布鲁氏菌可视化快速检测方法。针对布鲁氏菌外膜蛋白OMP25基因保守区设计6条特异引物,反应前加入染料羟基萘芬蓝(HNB)作为LAMP扩增的指示剂,63℃恒温反应60min,根据HNB的颜色变化进行结果判定。分别评价所建立LAMP方法的特异性和灵敏性,并对60份牛布鲁氏菌病虎红平板凝集试验(RBT)阳性血清样本,经LAMP和B4/B5-PCR方法进行平行检测。结果显示,本方法最低检出限约为17fg布鲁氏菌基因组DNA。本方法特异性良好,布鲁氏菌反应管均出现特异性LAMP扩增反应,而猪大肠杆菌K99、巴氏杆菌C48-1、猪链球菌ST171、绿脓杆菌等对照组均未出现扩增。针对60份RBT阳性血清的平行检测结果显示,LAMP和B4/B5-PCR这两种方法间的结果符合率为85.0%。B4/B5-PCR检测为阳性的43份样品,经本方法检测全部为阳性;B4/B5-PCR检测为阴性的17份样品,经本方法检测,9份为阳性,8份为阴性。LAMP的敏感性高于B4/B5-PCR方法。实验表明,本文所建立的基于颜色判定的布鲁氏菌LAMP检测方法具有特异、灵敏、设备要求简单等特点,适用于基层兽医部门进行布鲁氏菌的快速检测。