摘要：目的　构建血管内皮细胞生长因子受体 (VEGFR)Flt 1和KDR特异性短发夹环RNA(ShRNA)真核表达载体。方法　采用人U6SnRNA启动子 ,分别把被 9bp序列间隔的 19bp长短的Flt 1和KDR靶序列的反向重复序列 ,置于 pEGFP C1质粒载体中 ,分别构建成Flt 1和KDR短发夹环RNA ,产生重组质粒 pEGFP C1/U6/Flt 1及pEGFP C1/U6/KDR。分别用Pst和SalⅠ酶切鉴定 ;并将经酶切鉴定后的重组质粒作测序分析。结果　VEGF受体Flt 1和KDR的ShRNA片段被成功克隆进 pEGFP C1质粒中 ,SalⅠ酶切鉴定可切出 4 0 0bp大小的片段 ,DNA测序分析显示 ,重组质粒ShRNA编码序列与设计片断的序列完全一致。结论　针对Flt 1和KDR的特异性ShRNA真核表达载体PEGF/U6/Flt 1及PEGF/U6/KDR的成功构建 。

摘要：本研究观察小发夹RNA对白血病细胞血管内皮生长因子受体flt-1基因表达的抑制作用并探讨其对白血病细胞侵袭能力的影响及作用机制。采用脂质体介导的方法将构建的人flt-1基因特异性shRNA真核表达载体转染入K562细胞,用G418抗性筛选获得阳性克隆;抽提基因组DNA,用PCR方法验证shRNA基因对K562细胞的转染;以RT-PCR和免疫印迹反应检测flt-1 mRNA和蛋白表达量的变化;用Boyden小室体外侵袭实验检测白血病细胞的侵袭能力;RT-PCR方法检测白血病细胞MMP-2和MMP-9的表达。结果表明,flt-1基因特异性shRNA真核表达载体转染入白血病细胞株K562,G418筛选2周获得阳性克隆;PCR检测证实shRNA基因整合入白血病细胞基因DNA;携有shRNA的flt-1基因能明显下调白血病细胞内flt-1基因mRNA表达水平;设计的2种不同flt-1 shRNA序列能不同程度干扰flt-1基因和蛋白在细胞中的表达,两组阳性细胞中flt-1基因表达抑制率分别为46.1%和65.4%;flt-1 shRNA转染白血病细胞系K562细胞后,MMP-2和MMP-9 mRNA表达水平均较转染前明显下降;阳性细胞穿透人工重组基底膜的能力(4.3±1.2)%较对照组(12.7±1.9)%及(9.6±1.7)%明显降低(p<0.01)。结论:VEGF受体flt-1特异性shRNA的真核表达载体能够高效转染入白血病细胞株K562,有效抑制flt-1基因的表达,并使白血病细胞体外侵袭能力减弱,MMP-2和MMP-9 mRNA表达水平下降。这提示VEGF可能通过与其受体结合调控MMP-2和MMP-9的方式,参与白血病细胞的转移。