摘要：罗氏沼虾诺达病毒(Macrobrachium rosenbergii nodavirus,MrNV)是世界动物卫生组织规定必需上报的罗氏沼虾白尾病(whitetail disease,WTD)的主要病原体。为建立快速检测MrNV的套式RT-PCR方法,根据GenBank上发表的MrNV衣壳蛋白基因序列设计2对特异性引物,对PCR条件进行优化后通过特异性试验和敏感性试验检测其特异性和敏感性。结果表明:该方法能特异性地扩增出205 bp的MrNV衣壳蛋白基因片段,最佳引物浓度为0.8μmol/L、退火温度为56℃、Mg2+浓度为2.0 mmol/L,而对其他对虾病毒基因组均没有扩增出条带;检测MrNV的灵敏度大约为RT-PCR的103倍,最低可检测到2.612×10-2 fg MrNV RNA。应用套式RT-PCR和一步法RT-PCR同时对108份来自广西各地的罗氏沼虾临床样品进行检测,其中套式RT-PCR共有9份检出MrNV,而一步法RT-PCR仅有3份检出MrNV。由此可见,建立的套式RT-PCR检测方法具有极高的特异性和敏感性,能提高MrNV的阳性检出率,可用于MrNV急性感染和隐性感染的早期诊断,为WTD的临床检测、流行病学调查、进出口检疫和实验室研究提供可靠的技术手段。研究亮点:根据GenBank上发表的MrNV衣壳蛋白基因序列设计2对特异性引物,优化建立了检测MrNV的套式RT-PCR方法。该方法具有极高的特异性和敏感性,最低可检测到2.612×10-2fg MrNV RNA,能提高临床样品MrNV的阳性检出率,可用于MrNV急性感染和隐性感染的早期诊断。

摘要：【目的】基于TaqMan-MGB探针建立虾肝肠胞虫(EHP)荧光定量PCR检测方法,为EHP的快速定量检测及实时监测提供技术手段。【方法】以EHP的SSU rDNA基因为检测靶基因,在其保守区设计特异性的扩增引物和TaqMan-MGB探针,将PCR扩增目标片段克隆至pMD18-T载体构建重组质粒pMD18-T-SSU^EHP(标准品),以标准品DNA为模板优化反应体系,建立检测EHP的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR;以10倍梯度稀释的标准品DNA为模板构建扩增标准曲线,并进行特异性、敏感性、重复性及临床应用试验。【结果】制备的重组质粒pMD18-T-SSU^EHP DNA稳定性好,可满足作为标准品和阳性对照的要求;标准品(pMD18-T-SSU^EHP)起始模板范围为2.0×10^1~2.0×10^9拷贝/反应时,建立的标准曲线线性关系良好,对应的线性回归方程为y=-3.232×lg(x)+39.51。基于TaqMan-MGB探针建立的EHP荧光定量PCR对标准品的检测灵敏度可达20拷贝/反应,对临床虾样品EHP的检测灵敏度约10拷贝/mg,较农业农村部推荐的套式PCR约提高10倍;对虾类其他常见病原均无扩增反应,其组内和组间变异系数分别为0.26%~0.72%和0.56%~0.92%,整个检测过程可在1 h内完成。采用建立的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR与套式PCR同时对276份临床虾样品进行检测比较,发现两种方法的符合率为96.7%,检测低拷贝数虾样品时前者具有更高的灵敏度;2018和2019年广西虾样品的EHP阳性检出率分别为16.2%和30.6%。【结论】基于TaqMan-MGB探针建立的EHP荧光定量PCR检测方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量范围宽及简单快速等优点,适用于虾类样品的EHP定量检测,可为EHP实时监测及EHPD快速诊断提供一种新的技术手段。