摘要：背景:人羊膜含胶原、糖蛋白、蛋白多糖、整合素和板层体等多种成分,表达多种生长因子及其mRNA的相关蛋白,能为细胞的增殖、分化提供丰富的营养成分,有利于细胞的生长繁殖,其能否负载培养猪骨髓间充质干细胞良好生长值得研究。目的:建立人羊膜负载培养猪骨髓间充质干细胞生长的组织工程方法,观察骨髓间充质干细胞生长增殖的形态特点。设计:随机对照观察。单位:创伤、烧伤和复合伤国家重点实验室,解放军第三军医大学预防医学院全军复合伤研究所。材料:实验于2003-01/11在解放军第三军医大学预防医学院全军复合伤研究所,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室完成。选用3只出生二三个月的贵州小香猪,雌雄不拘,体质量6～8kg,由解放军第三军医大学实验动物中心提供。主要试剂:IMDM培养基(Hyclone,USA);优质胎牛血清PAA(Germany);Eosin B(Sigma,USA);OCT包埋剂(USA)。主要仪器:BX51立式荧光显微镜(Olympus,Japan);IX70型倒置荧光显微镜(Olympus,Japan);恒冷切片机(2700-Frigcut,德国);骨髓穿刺针(江苏);超净工作台(苏净集团安泰公司);CO2恒温培养箱(QUEUE,USA)。方法:按文献所述方法准备人羊膜,将按文献所述方法分离、培养的贵州小香猪骨髓间充质干细胞贵州小香猪的骨髓间充质干细胞原代培养、传代扩增后,以不同密度(0.84×105/cm2,1.54×105/cm2,2.75×105/cm2)接种于人羊膜基质面,倒置显微镜及扫描电镜下观察不同培养密度骨髓间充质干细胞的生长增殖变化情况;将第2、3代骨髓间充质干细胞以1.54×105/cm2的密度作为合适种植密度接种到由聚酯环支撑的人羊膜的基质面,最长培养至18d,逐日经卷膜、切片、苏木精-伊红染色光镜下观察人羊膜负载骨髓间充质干细胞生长情况,同时给予扫描及透射电镜。主要观察指标:不同培养密度及不同时间点骨髓间充质干细胞在人羊膜上的生长情况。结果:①不同种植密度人羊膜促进骨髓间充质干细胞生长比较:倒置显微镜下,以0.84×105/cm2细胞密度接种的骨髓间充质干细胞,细胞排列不规则、稀疏,间距大;以1.54×105/cm2细胞密度接种的骨髓间充质干细胞,细胞生长排列规则,密度适中,24h前细胞轮廓清楚,细胞活性好;以2.75×105/cm2细胞密度接种的骨髓间充质干细胞,细胞拥挤生长,12h后不见细胞轮廓,多见非贴附细胞,随时间的推移,细胞老化快,细胞碎屑多见。扫描电镜下,以0.84×105/cm2细胞密度接种的骨髓间充质干细胞,胞体肥大,呈不规则的长多边形扁平状,见粗细突起,细胞间距大;以1.54×105/cm2细胞密度接种的骨髓间充质干细胞,细胞密度适中,胞体肥大,呈不规则的长多边形扁平状,粗细突起较多,突起相互连接交织。细胞边缘有重叠现象;以2.75×105/cm2细胞密度接种的骨髓间充质干细胞,细胞拥挤重叠生长,周围突起不明显,边缘卷折,细胞碎屑多见。②不同时间点人羊膜负载骨髓间充质干细胞生长情况:倒置显微镜下,骨髓间充质干细胞接种在人羊膜的基质面后很快贴附生长,30min内就可见到骨髓间充质干细胞在人羊膜基质面上的贴附生长象。24h后可见几乎全部骨髓间充质干细胞贴附生长,细胞活力好,折光度强,48h后融合为单层,第4￣18天可见骨髓间充质干细胞在人羊膜的基质面密集生长。苏木精-伊红染色可见骨髓间充质干细胞在人羊膜的基质面呈放射状、漩涡状或平行生长,胞体较大,呈梭形,胞核居中、深染、大而清晰,细胞形态较为一致;扫描电镜下,骨髓间充质干细胞在人羊膜的基质面生长4d,排列密度适中,胞体肥大呈不规则的长多边形扁平状,粗细突起丰富,部分突起相互连接交织成网,胞膜形成突起牢固粘附于人羊膜基质上;透射电镜下,骨髓间充质干细胞在人羊膜的基质面生长4d切面,骨髓间充质干细胞在人羊膜上大多呈双层生长,细胞呈纺锤状,胞核两端胞浆突起较长,互相重叠,染色质以常染色质为主,核仁明显,可见丰富细胞器,如粗面内质网,线粒体。结论:人羊膜对骨髓间充质干细胞有明显的促增殖作用,骨髓间充质干细胞可以人羊膜为载体在体外进行培养,人羊膜是骨髓间充质干细胞的良好载体。