摘要：研究鱼蛋白胨和鱼油对替考拉宁产量和各组分含量的影响。通过在发酵培养基中选用不同原材料,比较结果发现,鱼蛋白胨2#和鱼油能分别提高替考拉宁的产量15.8%和21.0%。进而采用正交试验设计,确定了最佳发酵培养基配方。与对照组相比,在优化配方中添加0.5%鱼蛋白胨2#和0.8%鱼油可增加产量达35%,效价高达3000u/ml以上,且产品中各组分的相对百分含量不发生明显改变。为探求其原理,分别对不同原材料进行氨基酸组分分析和碘值测定,分析结果推测鱼蛋白胨的作用与原料中含有较高量的替考拉宁生物合成氨基酸前体有关,而鱼油则通过提供饱和脂肪酸,参与替考拉宁起始氨基酸的生物合成。同时也证明了通过筛选含不同化学结构成份的发酵碳氮原材料,可定向控制替考拉宁的生物合成。

摘要：目的通过成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统构建HMGB2基因敲除的小鼠巨噬细胞株(Raw264.7), 并验证肺炎克雷伯菌(KP)感染后HMGB2敲除细胞介导促炎因子产生和杀菌能力的变化。方法针对小鼠HMGB2基因靶向设计向导RNA(sgRNA), 将插入sgRNA的pX459质粒转染Raw264.7细胞, 利用抗性筛选和有限稀释法获得HMGB2基因敲除细胞克隆。利用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)对所获细胞克隆的HMGB2基因和蛋白表达进行鉴定。通过细菌计数测定HMGB2-/- Raw264.7吞噬和杀伤细菌能力, 通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测定HMGB2-/- Raw264.7促炎因子分泌情况。组间比较采用t检验。结果利用嘌呤霉素成功筛选出单克隆细胞株, HMGB2蛋白在敲除细胞株中完全不表达, HMGB2敲除后对KP的吞噬与正常细胞比较, 差异无统计学意义(2.37±0.31比2.33±0.15, t=0.17, P>0.05), 但感染后18 h胞内细菌存活比例显著高于正常细胞[(67.67±9.02)%比(32.33±6.11)%, t=5.62, P<0.01];KP感染HMGB2-/- Raw264.7, 促炎因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β和IL-6分泌量显著低于正常细胞[(54.00±18.08) pg/ml比(111.70±8.50) pg/ml, t=5.00, P<0.01;(65.67±9.87) pg/ml比(128.00±30.61) pg/ml, t=3.36, P<0.01;(72.67±9.07) pg/ml比(95.00±5.29) pg/ml, t=3.68, P<0.05]。结论通过CRISPR/Cas9技术成功构建HMGB2基因敲除Raw264.7细胞株, 验证了HMGB2对诱导相关炎性因子及抗KP感染的影响。

摘要：目的对肺炎克雷伯菌(KP)中标注的氨基肽酶(PepA)进行序列扩增与蛋白表达,鉴定其酶活特性。方法根据(美国)国家生物技术信息中心(NCBI)公布的KP PepA基因序列(Reference Sequence:NZ_CP045783.1)设计扩增引物,以本科室前期分离到的一株KP基因组为模板,通过聚合酶链反应(PCR)扩增出PepA基因全长,使用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后连接至表达载体pET-30a。将重组质粒pET-30a-PepA转化至大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达出KP PepA蛋白,使用N^(2+)层析柱对重组His标签蛋白进行纯化。以亮氨酸-对硝基苯胺(Leu-pNA)为底物,测定KP PepA对其水解能力,并摸索不同的反应温度和pH值条件对水解反应的影响。在反应体系中加入不同二价金属离子,观察各离子对KP PepA氨基肽酶活性的作用。组间比较采用t检验。结果扩增出长度为1527 bp的KP PepA基因,并获得可溶性KP PepA蛋白,大小为56.1×103,与预测大小一致。KP PepA加入组反应产物pNA浓度显著高于KP PepA不加组[(205.00±5.00)μmol/L比(8.00±2.00)μmol/L,t=63.36,P<0.01],表明重组KP PepA可以水解Leu-pNA。KP PepA水解Leu-pNA的最适温度为37℃,最适pH值为pH 8.0。Co^(2+)、Mn^(2+)均可以提高KP PepA酶活性,其中Co^(2+)激活作用最强,加入Co^(2+)组的相对酶活性显著高于不加离子组(181.70±7.64比95.00±0.00,t=16.44,P<0.01);Zn^(2+)、Fe^(2+)均可以抑制KP PepA酶活性,其中Zn^(2+)抑制作用最强,加入Zn^(2+)组的相对酶活性显著低于不加离子组(44.67±8.97比95.00±0.00,t=8.49,P<0.01)。结论肺炎克雷伯菌中标注的PepA具有体外氨基肽酶活性。

摘要：目的应用数学模型研究燀苦杏仁标准汤剂质量与其饮片中指标成分苦杏仁苷含量之间的相关性。方法制备燀苦杏仁标准汤剂,利用Design-Expert 8.0.6软件建立饮片出膏率、标准汤剂中苦杏仁苷含量、苦杏仁苷转移率分别与饮片中苦杏仁苷含量之间的3个线性回归模型。结果燀苦杏仁饮片出膏率为8.97%~12.12%;标准汤剂中苦杏仁苷含量为21.74%~30.32%;苦杏仁苷转移率为70.39%~90.54%。建立的3个线性回归模型R2均大于0.8,各项偏回归系数检验P值均小于0.05,具有显著性。3个线性回归模型均具有较好的准确性,预测值和实测值的相对偏差不大于10%,平均相对偏差不大于5%。结论该研究可预测不同燀苦杏仁饮片制备所得标准汤剂的质量,为制定其标准汤剂的质量标准提供一定参考价值。

摘要：目的探究肺炎克雷伯菌(KP)外膜蛋白A(OmpA)是否可以激活Raw264.7巨噬细胞NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)炎症小体。方法根据(美国)国家生物技术信息中心(NCBI)公布的KP OmpA基因序列(GenBank Number:AJ000998.1),以本科室保存的KP菌株基因组为模板,设计引物,通过聚合酶链反应(PCR)扩增OmpA全长序列并经同源重组酶连接至慢病毒表达载体pLVX-AcGFP1-N1。将该重组表达载体与慢病毒包装质粒pLP1,pLP2和pLPVSV-G共转染HEK293T细胞,收集慢病毒液并感染Raw264.7巨噬细胞,经有限稀释法筛选获得表达KP OmpA的Raw264.7单克隆细胞株。使用蛋白质印迹法(Western blot)和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测NLRP3、半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-18(IL-18)表达。组间比较采用t检验。结果成功包装出慢病毒并获得稳定表达KP OmpA的Raw264.7细胞系,KP OmpA稳转细胞系胞内NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β灰度值显著高于空载细胞系(1.17±0.01比0.71±0.01,t=31.170,P<0.01;2.25±0.06比1.43±0.07,t=8.909,P<0.05;1.82±0.06比1.25±0.01,t=8.900,P<0.05;1.41±0.06比0.58±0.01,t=12.860,P<0.01)。KP OmpA稳转细胞系细胞上清中IL-1β和IL-18表达量显著高于空载细胞系[(215.70±14.93)pg/ml比(20.37±9.86)pg/ml,t=10.920,P<0.01;(115.90±14.88)pg/ml比(15.40±4.72)pg/ml,t=6.434,P<0.05]。结论肺炎克雷伯菌外膜蛋白OmpA可以激活Raw264.7巨噬细胞NLRP3炎症小体,并上调炎性因子IL-1β和IL-18表达。