摘要：目的:设计并筛选人血管内皮生长因子(VEGF)有效RNA干扰片段,构建VEGF慢病毒表达载体。方法:对人VEGF基因编码区分析,筛选序列3条,阴性对照序列l条,通过连接线性化的plenti6.3-MIR载体,构建miRNA慢病毒载体质粒,并转化至感受态细胞DH5α,进行测序验证。在脂质体介导下转染293T细胞,包装生产慢病毒,测定其滴度。慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L,用Real-time PCR检测干扰效果。结果:测序证实3个VEGF基因RNAi慢病毒载体质粒构建成功。慢病毒载体经293T细胞包装成功,测定病毒的滴度分别为3.23×109、3.30×109、3.73×109TU/mL。3个慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L后,VEGF基因在mRNA水平受到抑制,其中miR-200序列效果最佳,对VEGF基因表达的干扰效率可达72%。结论:成功构建并筛选了人VEGF基因RNAi慢病毒载体及有效靶点,为进一步深入研究VEGF基因与抗肿瘤药物药效关系提供实验基础。

摘要：目的构建VEGF基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体并实现其在人肝癌细胞MHCC97L中表达。方法根据人VEGF基因序列,设计并合成包含靶序列的互补DNA链,连接线性化的plenti6.3-MIR载体,构建miRNA慢病毒载体质粒,并转化至感受态细胞DH5α,进行测序验证。在脂质体介导下转染293T细胞,包装生产慢病毒,测定其滴度。慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L,用Real-time PCR检测RNAi组(MHCC97-200)、阴性对照组(MHCC97-NEGA)和空白对照组(MHCC97-空白)中VEGF的表达情况,确定其干扰VEGF表达的有效性。结果测序证实慢VEGF基因RNAi病毒载体质粒构建成功。慢病毒载体经293T细胞包装成功,测定病毒的滴度为3.23×109TU/mL。慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L 48 h后,VEGF基因在mRNA水平抑制了72.2%。结论 VEGF基因RNAi慢病毒载体构建成功,并实现在人肝癌细胞MHCC97L中的表达。