摘要：背景:RNA干扰技术的应用,关键在于能够采用1个有效的基因转移系统将小干扰RNA转入至靶细胞,目前广泛应用的是构建小干扰RNA表达载体。目的:利用AdMax腺病毒载体系统构建表达人甲胎蛋白-小干扰RNA的腺病毒载体。设计、时间及地点:开放性实验,于2007-03/10在山东大学附属济南市中心医院中心实验室完成。材料:穿梭质粒pDC316-EGFP-U6为本元正阳基因技术公司产品;AdMax KitD试剂盒与低代数HEK293细胞为Microbix Biosystem sInc.(Canada)公司产品。方法:选择针对甲胎蛋白mRNA的特异性小干扰RNA靶序列,设计合成为相应的双链DNA,并将其与酶切线性化的pDC316-EGFP-U6载体片段连接,构建好的穿梭质粒pDC316-EGFP-U6-AFP-siRNA和腺病毒骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre共转染HEK293细胞,同源重组产生重组腺病毒。主要观察指标:对重组腺病毒进行聚合酶链反应鉴定及扩增、纯化、滴度测定。结果:构建的穿梭质粒载体经聚合酶链反应鉴定和测序分析,证实与设计一致。重组腺病毒Ad-AFP-siRNA经聚合酶链反应和绿色荧光蛋白表达检测证实构建成功,测定滴度为1.4×109nfu/L。结论:实验成功构建了Ad-EGFP-U6-AFP-siRNA重组腺病毒。

摘要：背景:分化型胚胎软骨基因1可调控肿瘤生长、凋亡、衰老相关因子,与肿瘤的发生发展有着重要的联系。目的:构建针对人分化型胚胎软骨基因1的小干扰RNA表达载体。方法:从NCBI中查找人分化型胚胎软骨基因1基因全长mRNA序列,利用Katahdin提供的在线小干扰RNA模板序列设计软件,设计针对分化型胚胎软骨基因1的2条shRNA的DNA模板单链,合成靶向分化型胚胎软骨基因1基因转录可形成茎环结构的寡聚核苷酸,退火后与酶切后的pGreenPuroTM shRNA Cloning and Expression Lentivector质粒连接,在JM-109菌株中扩增,并进行质粒DNA琼脂糖凝胶电泳分析、紫外分光光度计检测、菌落PCR以及测序鉴定。结果与结论:将含有分化型胚胎软骨基因1目标序列25bp的双链DNA插入片段,连接到pGreenPuroTM shRNA Cloning and Expression Lentivector质粒形成重组质粒。质粒DNA琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计分析结果确认所提质粒纯度较高,可用于后续实验。菌落PCR结果表明产物大小约为170bp,与预期相符。测序结果表明pGreenPuroTM shRNA Cloning and Expression Lentivector质粒已经插入人分化型胚胎软骨基因1的干扰合成片段,无碱基突变。成功构建了靶向分化型胚胎软骨基因1-小干扰RNA表达载体。

摘要：目的优化敏感性及特异性更高的新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸检测试剂盒,提高阳性检出率。并与市售试剂盒进行对比,对临床使用提出指导。方法收集2020年1月至3月在山东大学附属济南市中心医院等6家2019-nCoV核酸检测单位的确诊患者88例及阴性患者572例,共计660例。通过对2019-nCoV的全基因组进行序列分析,设计更加灵敏的引物、探针,优化buffer配比及扩增过程。采用交叉实验及内源性物质干扰实验评价其特异性。另外选择3家市售核酸检测试剂盒,对梯度稀释的阳性核酸样本进行对比验证实验。结果优化后的开放读码框1a/b(ORF1ab)、核衣壳蛋白(N)对于2019-nCoV的RNA靶点,比市售试剂盒具有更高的灵敏度。当核酸样本中1个病毒浓度为1个拷贝时即可检出,同时扩增曲线更加优越。相比较与世界卫生组织(WHO)或自行设计引物的试剂盒,ORF1ab的灵敏度提高了2倍(1∶10 vs 1∶5);而N基因的灵敏度比中国疾病预防控制中心(CDC)和自行设计引物的试剂盒提高了8倍(1∶80 vs 1∶10),比WHO试剂盒提高了2倍(1∶80 vs 1∶40)。临床验证实验显示,鼻咽拭子检测准确度均为100%,与其他感染部位相同或感染症状相似的其他病原体无交叉反应,试剂盒的分析特异性为100%,阳性符合率和阴性符合率均为100%。结论优化后的2019-nCoV核酸检测试剂盒具有更高的检测灵敏度和特异性,有助于解决核酸检测假阴性,提高阳性率,将对低病毒载量患者及出院患者的判定具有重要的意义。

摘要：背景:研究发现,Lewis血型抗原与多种恶性肿瘤关系密切,岩藻糖基转移酶(fucosyltransferase,FUTs)是参与合成Lewis抗原的关键酶,FUT3是其中之一。目的:设计并构建靶向FUT3基因的miRNA干扰质粒,为探索肿瘤基因治疗新途径奠定基础。设计、时间及地点:单一样本观察,于2007-05/10在济南市中心医院医学实验诊断中心完成。材料:BLOCK-iTTM PolⅡmiR RNAi Expression Vector Kits(含荧光基因GFP)、T4DNA连接酶购自invitrogen公司;大肠杆菌菌株One Shot TOP10购自invitrogen公司。方法:根据GenBank中FUT3的序列,应用***网站的设计软件设计、合成针对FUT3 miRNA的相应Oligo DNA,退火后与BLOCK-iTTM Pol ⅡmiR RNAi Expression Vector相连接,转化感受态***10。主要观察指标:①重组质粒DNA序列分析。②质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳检测。③紫外分光光度计检测。④聚合酶链反应鉴定。结果:经测序鉴定和聚合酶链反应鉴定证实成功构建针对人FUT3基因的miRNA干扰质粒pcDNATM6.2-GW/EmGFP-FUT3-miR;质粒DNA的琼脂凝胶电泳检测和紫外分光光度计分析结果确认所提质粒纯度较高,可以用于后续试验。结论:FUT3靶向miRNA表达载体构建成功。

摘要：目的:研究siRNA干扰尼古丁乙酰胆碱受体α5(cholinergic receptor nicotinic alpha5,CHRNA5)基因表达后对尼古丁促人肺癌A549细胞增殖作用的影响。方法:设计并合成CHRNA5-siRNA片段,并经脂质体介导转染A549细胞。荧光定量PCR、Western blotting检测转染后A549细胞中CHRNA5 mRNA和蛋白的表达,MTT法检测CHRNA5-siRNA对尼古丁促A549细胞增殖作用的影响。结果:成功构建了CHRNA5-siRNA并成功转染A549细胞。CHRNA5-siRNA转染组A549细胞的CHRNA5mRNA表达量明显低于si-NC转染对照组(0.196±0.044vs0.944±0.027,P<0.01),CHRNA5-siRNA转染组A549细胞的CHRNA5蛋白表达量明显低于si-NC转染组(0.267±0.031vs0.745±0.035,P<0.01)。在无尼古丁作用时,CHRNA5-siRNA的转染不能抑制A549细胞的增殖。在尼古丁作用下,A549细胞增殖显著增加(P<0.01),CHRNA5-siRNA转染可明显抑制尼古丁的促增殖作用(P<0.01)。结论:siRNA下调肺癌A549细胞中CHRNA5的表达可以抑制尼古丁促细胞增殖作用,CHRNA5可能是肺癌治疗的潜在靶点之一。

摘要：目的构建针对人甲胎蛋白(AFP)基因的miRNA表达质粒,为进一步研究AFP基因功能奠定基础。方法沿mRNA序列寻找连续两个AA及后面的19个核苷酸,通过同源性比较,选择与其他任何基因无同源性的序列即作为潜在的miRNA靶位点,针对AFP基因的编码序列体外合成两段互补的寡核苷酸,与线性化的pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR RNAi EXPRESSION VECTOR载体连接后转化大肠杆菌,扩增、纯化获得所需质粒,以琼脂糖凝胶电泳、PCR及基因测序鉴定其相对分子质量及插入片段的序列。结果纯化质粒的相对分子质量为5.8 kb,PCR鉴定结果符合目的条带(260 bp左右)大小,插入的寡核苷酸序列与设计的序列完全相符。结论成功构建了针对人AFP基因的miRNA表达质粒。

摘要：目的体外研究非小细胞肺腺癌A549细胞中CHRNA5基因表达下调对尼古丁促肺癌细胞增殖及VEGF表达的影响。方法实验分为0μmol/L尼古丁组、1μmol/L尼古丁组、转染阴性对照组(1μmol/L尼古丁+si-NC)和转染组(1μmol/L尼古丁+CHRNA5-siRNA)。设计合成编码α5-nAChR的CHRNA5基因siRNA片段,脂质体介导转染A549细胞,RT-PCR检测CHRNA5-siRNA转染后α5-nAChR和VEGF mRNA水平的表达,Western blotting检测转染后α5-nAChR蛋白水平的表达,ELISA法检测转染后细胞上清液中VEGF蛋白水平的表达,CCK-8方法检测α5-nAChR下调对尼古丁促肺癌细胞增殖的影响。结果 CHRNA5-siRNA转染A549细胞后,转染组α5-nAChR和VEGF mRNA表达和蛋白表达量明显低于转染阴性对照组(P<0.05),且显著抑制尼古丁促肺癌细胞的增殖(P<0.05)。结论α5-nAChR表达下调能抑制尼古丁促肺癌细胞的增殖,降低VEGF的表达。α5-nAchR及其信号转导系统在吸烟相关性肺癌发生、发展中可能发挥重要作用,可作为肺癌预后预测指标和治疗靶点。

摘要：目的探讨靶向羧肽酶B2(CPB2)基因的小干扰RNA(siRNA)对乳腺癌MDA-MB-231细胞凝血酶激活的纤溶抑制物(TAFI)表达以及对乳腺癌细胞的生长和转移的影响。方法将细胞分为siRNA-1组、siRNA-2组、siRNA-3组、阴性对照组和空白对照组5组,设计并化学合成编码TAFI基因(CPB2)的特异性siRNA,用脂质体2000转染至MDA-MB-231细胞中,采用Western blot、RT-PCR分别检测各组TAFI蛋白及mRNA的表达,Transwell侵袭实验检测癌细胞转移侵袭能力,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞存活和生长情况。结果 siRNA抑制CPB2表达后,TAFI蛋白及其mRNA表达水平显著下降,siRNA-1组、siRNA-2组、siRNA-3组与阴性对照组比较细胞侵袭力和细胞生长都明显受到抑制(P<0.05)。结论靶向CPB2的siRNA可有效下调乳腺癌细胞MDA-MB-231中TAFI蛋白及其mRNA表达水平,降低肿瘤细胞的侵袭力,抑制细胞的生长和转移。

摘要：目的构建针对信号转导子和转录激活子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)的小干扰RNA(siRNA)表达载体STAT3-siRNA,研究siRNA干扰STAT3基因表达后对人胃癌细胞株HGC-27细胞增殖作用的影响。方法设计并合成两个STAT3-siRNA片段,经脂质体介导转染HGC-27细胞,RT-PCR和Westernblot检测转染后HGC-27细胞中STAT3 mRNA和蛋白的表达,MTT法检测STAT3-siRNA对HGC-27细胞增殖作用的影响。结果酶切及测序鉴定证实STAT3-siRNA1和STAT3-siRNA 2表达载体均构建成功。RT-PCR和Western blot结果显示,转染后STAT3 mRNA和蛋白的表达量均下降,与空白对照组及si-NC转染对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.01),其中以STAT3-siRNA1干扰效果更明显。MTT结果显示,转染STAT3-siRNA1后,HGC-27细胞的增殖能力明显下降,与si-NC转染对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论本研究构建的STAT3-siRNA表达载体可有效抑制STAT3在胃癌细胞株HGC-27中的表达,并抑制胃癌细胞的生长。

摘要：目的:构建针对人甲胎蛋白(AFP)基因siRNA表达质粒,为进一步研究AFP基因功能奠定基础?方法:选择RNA干涉靶序列,体外合成两段互补的寡核苷酸,通过与线性化的pSilencer3.0-H1连接?转化大肠杆菌,扩增?纯化得到所需质粒,通过琼脂糖凝胶电泳及基因测序鉴定其分子量及插入片段的序列?结果:纯化的质粒的分子量为2.8 Kb,插入的寡核苷酸序列与设计的序列完全相符?结论:成功构建了针对AFP基因的siRNAs表达质粒?