摘要：目的:构建人源annexinA2基因片段的原核表达载体,表达并纯化蛋白,制备多克隆抗体。方法:从GenBank(BC093056.1)中获得人源annexinA2基因的cDNA序列并根据不含信号肽的编码序列设计引物,用PCR的方法扩增编码an-nexinA2基因部分序列,将其克隆到原核表达载体pET28a(+)中表达annexinA2的蛋白。表达的蛋白产物利用切胶回收的方法纯化,用His抗体进行Western blot鉴定。用纯化的目的蛋白作为抗原免疫日本大耳白兔,获得annexinA2的抗血清,通过ELISA测定兔多克隆抗体的滴度。在CaSki细胞内采用细胞免疫荧光(CIF)和流式细胞术(FCM)检测内源annexinA2蛋白的表达,用于鉴定制备的多克隆抗体特异性。结果:通过双酶切及测序证实原核表达质粒pET28a(+)-annexinA2构建成功,可在大肠杆菌*** BL21(DE3)中诱导高表达,得到相对分子质量约28 000的annexinA2蛋白。纯化的蛋白免疫日本大白兔后,产生特异的高滴度的抗体(ELISA滴度达1∶640 000)。CIF和FCM结果显示抗血清与肿瘤细胞表达的annexinA2有高度特异的结合活性。结论:构建了annexinA2的原核表达质粒并获得高纯度的蛋白,免疫动物后,获得了特异、高效价的多克隆抗体,为人源annexinA2蛋白的生物学功能及肿瘤治疗的研究提供了实验基础。

摘要：目的:设计原核表达小鼠钙网蛋白(Calreticulin,CRT)与程序性死亡分子1(Programmed Death-1,PD1)的融合蛋白,用于肿瘤靶向治疗。方法:应用RT-PCR技术扩增小鼠CRT的N、P区基因及PD1胞外区cDNA序列,用一个Linker将两者连接起来,克隆至表达载体pET28a(+)上。将重组表达质粒pET28a(+)-CRT-SPD1转化入大肠杆菌BL21(DE3)内,IPTG诱导表达;用Ni柱亲和层析纯化蛋白,并进行SDS-PAGE、Western blot鉴定。结果:所得产物经SDS-PAGE检测后,在45 kDa处显示特异条带,最后经Western Blotting鉴定,所纯化蛋白能被CRT抗体和PD1抗体抗体识别。结论:获得较纯的融合蛋白,所构建的载体可为进一步研究两者的功能和免疫学特性及肿瘤的免疫治疗奠定了基础。