摘要：本研究以‘夏黑’葡萄(Vitis vinifera)为实验材料,通过调节不同植物生长调节剂浓度配比,探究‘夏黑’葡萄愈伤组织诱导及生根诱导的最适培养基,并在最适培养基条件下,以无菌苗叶片和绿色、黄绿色愈伤组织为材料,对原生质体提取及转化条件进行优化。结果表明,最适合茎段诱导芽的培养基为MS+1.0mg·L^(-1)6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)+0.02 mg·L^(-1)α-萘乙酸(NAA),最适合茎段愈伤诱导的培养基为MS+1.0mg·L^(-1)6-BA+0.1 mg·L^(-1)NAA,最适合叶柄愈伤诱导的培养基为MS+2.0 mg·L^(-1)6-BA+0.1 mg·L^(-1)NAA,最适合叶片诱导的培养基为MS+2.0 mg·L^(-1)噻苯隆(TDZ)+1.0 mg·L^(-1)2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)+0.2 mg·L^(-1)吲哚丁酸(IBA),最适合夏黑葡萄生根诱导的培养基为1/2MS+0.5 mg·L^(-1)IBA。以葡萄无菌苗叶片为最佳原生质体提取材料,在纤维素浓度为30 g·L^(-1)、离析酶浓度为5 g·L^(-1)、果胶酶浓度为4 g·L^(-1)、甘露醇浓度为0.6mol·L^(-1)时,28°C黑暗条件下酶解6 h,抽真空处理50 min后分离的原生质体最为理想。将能表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组质粒pCAMBIA1302利用聚乙二醇4000(PEG4000)介导法转化原生质体后,观察到强烈的绿色荧光信号,表明分离的葡萄原生质体可以用作基因瞬时表达体系;并且当PEG4000浓度为300 g·L^(-1)时,转化效果最佳。利用CRISPR-P工具在葡萄VvZEP基因的第一个外显子中设计了2个sgRNA,通过酶切、PCR重组构建了含有2个靶标位点的靶向于VvZEP基因的CRISPR/Cas9载体pGREBn-VvZEP,为后续基因编辑载体转入葡萄原生质体提供了基础。

摘要：为了明确TPS基因家族在葡萄非生物胁迫下的表达特性,在生物信息分析的基础上,以‘鄞红’葡萄(Vitis vinifera‘Yinhong’)扦插苗为试验材料,利用RT-qPCR技术检测了盐胁迫和光胁迫处理对葡萄TPS家族基因成员表达的影响。结果显示,葡萄TPS基因家族有9个成员,可分为3个亚族,分布在8条染色体上。通过氨基酸多重序列比对,发现葡萄(Vitis vinifera)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)和水稻(Oryza sativa)TPS家族基因都存在G-X-FLH-X-PFPS-X-E-X5-P-X-R和X-F-X-T-X-D-X-ARHF-X2的特征序列。motif分析发现,VvTPS06和VvTPS07两个基因含有相同的氨基酸保守序列。亚细胞定位预测显示葡萄TPS基因主要分布在细胞质、叶绿体和细胞核中,其中VvTPS06、VvTPS07、VvTPS09定位于叶绿体中可能与植物光合作用相关。蛋白质二级结构表明,葡萄TPS蛋白主要以α-螺旋和无规则卷曲为主。基因芯片表达显示,VvTPS02、VvTPS03、VvTPS05、VvTPS07在葡萄不同时期不同组织均处于高表达状态,其中VvTPS07尤为明显。RT-qPCR分析结果表明,在盐胁迫中各VvTPS基因存在相似的表达模式,VvTPS05、VvTPS07和VvTPS09的表达量在高浓度盐胁迫(0.6%)时出现一定程度的升高,这表明VvTPS05、VvTPS07和VvTPS09基因与植物耐盐性关系密切,可为葡萄逆境胁迫机制研究提供参考。在光胁迫中,当遮光率达90%时,VvTPS02、VvTPS07和VvTPS09的表达量相比于对照组明显增加,推测其通过提高其表达量来促进光合作用,从而弥补光照的缺失。