摘要：目的构建鸡耳蜗EFNA2基因的RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,在离体培养原代鸡听神经细胞中鉴定其沉默效率。方法针对鸡EFNA2基因序列设计特异性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)靶点,构建慢病毒pFU-GW-iRNA载体,将筛选所得有效短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体在293T细胞中包装成病毒颗粒,随后将其感染离体培养原代鸡听神经细胞,最后采用Real-time PCR检测靶基因的沉默效率。结果 PCR克隆鉴定及测序结果显示所构建的shRNA慢病毒载体正确无误,包装病毒后的滴度为2.0×109 TU/ml,分别命名为LV-GFP-EFNA2-shRNA-l、LV-GFP-EFNA2-shRNA-2和LV-GFP-EF-NA2-shRNA-3。ShRNA慢病毒颗粒感染目的细胞后,EFNA2基因的mRNA表达量较阴性对照载体慢病毒感染组分别下降了76.11%、61.87%和68.44%。结论本研究成功构建了鸡EFNA2基因的RNAi慢病毒表达载体,并能在离体培养的原代鸡听神经细胞中有效沉默靶基因。

摘要：目的构建CD44基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒表达载体并在下咽癌FaDu细胞株上鉴定其沉默效率,为研究目的基因沉默后下咽癌肿瘤细胞致瘤性的改变提供稳定可靠的载体。方法针对目的基因CD44mRNA的序列,按照RNA干扰序列的设计原则,设计、合成4个CD44基因特异性小分子干扰iRNA(small interference RNA,siRNA)靶点,将其合成短发卡hRNA(short hairpin RNA,shRNA)并退火成双链DNA,与慢病毒载体重组形成shRNA表达载体,利用PCR和测序鉴定获取正确克隆。将筛选出的最有效重组载体与慢病毒包装质粒共转染293T细胞并测定病毒滴度。随后将其感染下咽癌FaDu细胞株细胞,采用Real-time PCR检测靶基因的沉默效率。结果对LV-CD44-shRNA载体进行双酶切鉴定,证实短发夹RNA正确插入慢病毒载体,DNA测序证实插入序列正确,CD44基因RNA干扰重组慢病毒载体经293T细胞成功包装后,其病毒滴度为8E+8TU/ml。RNA干扰下咽癌FaDu细胞CD44基因后,CD44 mRNA水平显著下降,干扰效率大于70%。结论成功构建了CD44基因的shRNA慢病毒表达载体,能够在细胞水平有效沉默靶基因,为CD44基因沉默后下咽癌肿瘤细胞生物学改变的研究打下了较坚实的基础。