摘要：【目的】对日本抗性黑松体细胞胚成熟的影响因子进行研究,探究各因素在体细胞胚发生过程中的作用,为进一步提高体细胞胚发生的质量和数量提供理论依据。【方法】胚性细胞团在固体增殖培养基上继代生长10天,使用灭菌(75%乙醇擦拭、紫外灭菌30 min)的电子天平称量1 g胚性细胞团,采用50 mL无菌量筒(紫外灭菌30 min)量取30 mL培养液中于100 mL的三角瓶中,将1 g胚性细胞团转至100 mL的三角瓶中,手动搅拌至细胞团分散,置于90 r·min^(-1)摇床上,25℃黑暗培养7～8天。随后,取3 mL沉淀悬浮细胞进行继代增殖,每星期继代增殖一次至胚性细胞全部均匀散落于培养液。将继代4次的胚性细胞充分摇匀,取2 mL(鲜质量约200 mg)胚性悬浮细胞喷洒在不同组分麦芽糖(30、45、60 g·L^(-1))、脱落酸(ABA)(0、5、10、20、30、50 mg·L^(-1))、聚乙二醇(PEG8000)(0、50、75、100、125、150 g·L^(-1))、活性炭(AC)(1、2、3 g·L^(-1))、琼脂(琼脂6、8、10、12 g·L^(-1),植物凝胶2、2. 5、3、3. 5 g·L^(-1))以及麦芽糖、ABA、PEG 3因素的组合固体成熟培养基上。【结果】以#1337为材料的体细胞胚成熟发育过程中,麦芽糖45 g·L^(-1),获得的体细胞胚数量显著增多。ABA浓度为5～20 mg·L^(-1),体细胞胚数量呈显著上升趋势,ABA为20 mg·L^(-1)时,获得的体细胞胚最多。125 g·L^(-1)PEG8000为体胚发生最佳浓度; AC 2 g·L^(-1)时,胚性细胞形成结构完整、数量较多的成熟体胚;成熟培养基中添加琼脂粉,培养基不能凝固,植物凝胶更适合作为成熟培养基凝固剂。3 g·L^(-1)植物凝胶为抗性黑松体胚发育成熟的最佳浓度。在设计的9种成熟培养基组合中(胚性细胞#1337、#1537、#1637),胚性细胞产生体细胞胚最多的成熟培养基组合为麦芽糖45 g·L^(-1)、ABA 10 mg·L^(-1)、PEG8000 125 g·L^(-1)。在不同的麦芽糖、ABA和PEG组合中,不同无性系生产体细胞胚数量呈现出不同的变化趋势:胚性细胞系#1337体胚发育成熟的最佳组合为麦芽糖45 g·L^(-1)+ABA 10 mg·L^(-1)+PEG 125 g·L^(-1);#1537和#1637体胚发育成熟的最佳组合为麦芽糖30 g·L^(-1)+ABA 10 mg·L^(-1)+PEG 125 g·L^(-1);在3个无性系中PEG的极差最大,对抗性黑松体细胞胚发育成熟的影响最大。【结论】抗性黑松体胚发育成熟过程中,麦芽糖45 g·L^(-1)、ABA20～30 mg·L^(-1)、PEG8000 125 g·L^(-1)、AC 2 g·L^(-1)和植物凝胶3 g·L^(-1)对体细胞胚成熟都具有促进作用。30 g·L^(-1)麦芽糖、10 mg·L^(-1)ABA、125 g·L^(-1)PEG为抗性黑松体胚发育成熟的最佳组合。

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