摘要：目的建立检测人感染新型甲型禽流感H7N9病毒的四重荧光定量RT-PCR方法。方法以人细胞RNA酶P(RNase P)基因为内参,用Primer Express3.0软件设计PCR特异性引物和探针。通过不同来源的呼吸道病毒进行特异性分析,构建质粒标准品用于分析该方法的灵敏度和重复性,并对1 896例临床标本进行回顾性检测。结果该方法检测甲型流感病毒(Flu A)、H7、N9与RNase P灵敏度均达102copies/m L,特异性达100%,每对引物和探针只检测出相应的病毒,无交叉反应,检测变异系数(CV)均低于1.55%。用该法检测1 896例临床标本,结果 Flu A 235例,H7N9 127例,与其他试剂报告结果完全一致。结论建立的四重荧光定量RT-PCR法可快速检测H7N9病毒,灵敏度与特异性好,可用于H7N9病毒感染患者的早期诊断。

摘要：目的建立同时检测柯萨奇病毒A2和A5型(CVA2、CVA5)的双重实时荧光定量RT-PCR法。方法用Primer Express3.0软件设计高度特异性引物和荧光标记探针。通过优化反应体系,建立标准曲线,并评价双重荧光定量RT-PCR法的特异性、灵敏度和重复性。用建立的方法检测367例疑似手足口病患儿的粪便标本,并对阳性结果测序验证。结果荧光定量RT-PCR结果表明本实验所选的引物和探针可特异性检测并区分出CVA2、CVA5亚型,与其他肠道病毒的阳性核酸未发生交叉反应。该方法最低检测限达到102copies/m L,批内变异系数(CV)均<1.49%。367份临床标本中CVA2型阳性23份,阳性率6.3%;CVA5阳性11份,阳性率3%,检测阳性结果与测序结果一致。结论成功建立了在单管中同时检测并鉴别CVA2、CVA5型的双重实时荧光定量RT-PCR检测方法。该方法具有较好的灵敏度、特异性、重复性,可用于CVA2、CVA5型引起的暴发疫情的快速筛查和手足口病的流行病学的研究。