摘要：为获得单增李斯特菌溶血素(Listeriolysiono,LLO)蛋白及其多克隆抗体。根据单增李斯特菌溶血素蛋白的基因Hly序列设计了一对特异性引物,扩增出Hly基因,克隆入原核表达载体p ET-32a,并转化于大肠杆菌BL21中,在诱导剂IPTG的作用下重组LLO蛋白成功表达。SDS-PAGE结果表明重组蛋白分子量约为69.3 ku,且主要以包涵体形式表达LLO蛋白。将重组蛋白纯化后免疫新西兰大白兔,获得兔抗LLO抗体。Western-blot检测到一条约69.3 ku的特异性条带,表明该抗体具有较强的特异性。单增李斯特菌溶血素基因Hly在大肠杆菌中已成功表达,且制备的多克隆抗体可用于LLO蛋白的检测。

摘要：根据已发表的禽腺联病毒(AAAV)基因组序列设计了1对引物,经PCR扩增出VP3基因,将其克隆入原核表达载体pET-30a,并转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下VP3蛋白获得了正确表达,SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白的分子质量正确。将目的蛋白切胶免疫ICR小鼠,制备了针对重组蛋白VP3的多抗血清,Western-blot结果显示,制备的抗血清能够与AAAV VP抗原发生特异反应。结果表明,VP3基因在大肠杆菌中获得了成功表达,且制备的多抗血清可以用于VP基因的表达检测。

摘要：根据GenBank上致仔猪水肿病大肠杆菌志贺毒素(Stx2e)A单位基因序列(M21534)以及Red重组系统试剂盒提供的FRT-PGK-gb2-neo-FRT序列设计1对引物;引物的5′端与Stx2e基因同源,3′端与FRT-PGK-gb2-neo-FRT序列同源。使用合成的引物利用PCR扩增FRT-PGK-gb2-neo-FRT序列片段。将扩增的PCR片段转化带有pRedET重组质粒的产志贺毒素大肠杆菌(STEC)S451521菌株(F18+)的感受态细胞中,通过同源重组技术替换Stx2eA单位基因的805～1 152bp区域。通过卡那霉素抗性以及PCR检测获得同源重组的STEC后,将708-FLPe质粒进一步转化重组菌,利用Flp重组酶去除了重组菌的卡那霉素抗性。另外,研究还发现Stx2e基因在STEC基因组中并非单拷贝。

摘要：为在昆虫细胞中表达Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒(Duck hepatitis A virus type-I,DHAV-I)SH株的主要结构蛋白VP3,首先根据DHAV-I SH株VP3基因序列设计1对引物,RT-PCR方法扩增出VP3基因,克隆至杆状病毒表达载体p Fast Bac1,获得重组杆状病毒转移载体p FB-VP3,将其转化到DH10Bac感受态细胞中,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒r Bacmid-VP3,在脂质体介导下转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒r Bac-VP3。间接免疫荧光结果显示重组蛋白获得了正确表达,能与鸭抗全病毒阳性血清发生特异性反应。Western blot结果显示表达的重组蛋白分子量约为27 000。表明,DHAV-I SH株的主要结构蛋白VP3在昆虫细胞中获得了成功表达,为VP3结构蛋白的功能研究及相关亚单位疫苗的研制奠定了基础。

摘要：根据禽腺联病毒Rep基因序列设计2对引物,分别扩增出Rep78和Rep52基因,将其克隆至杆状病毒双表达载体pFastBacDual,获得重组穿梭质粒pFastBacDual-Rep,将其转化到*** DH10Bac感受态细胞中,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组病毒表达质粒rBacmid-Rep。在脂质体的介导下转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒rBac-Rep。SDS-PAGE结果分析表明,Rep78、Rep52均获得了表达,Western blot结果显示表达的重组蛋白能够与Rep52多抗反应,具有良好的反应原性。结论:禽腺联病毒的非结构蛋白Rep78、Rep52基因在昆虫细胞中获得了成功表达。

摘要：根据禽腺联病毒VP基因序列设计引物,扩增出VP基因,将其克隆至杆状病毒表达载体pFastBac1,经酶切鉴定筛选出阳性重组转移载体pFastBac-VP,并对阳性质粒进行测序及序列分析;将pFastBac-VP转化到DH10Bac感受态细胞中,与Bacmid发生位点特异性转座作用,经抗性和蓝白斑筛选,获得含VP基因的重组穿梭载体rBacmid-VP。研究结果为进一步在昆虫细胞中表达VP基因,开发研制重组禽腺联病毒载体奠定了基础。

摘要：为在毕赤酵母中表达人溶菌酶基因,根据已发表的人溶菌酶基因序列设计引物,扩增人溶菌酶全基因片段,将其克隆进巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,构建重组质粒pPIC9K-LYZ,经Sac I酶切线性化后电转化毕赤酵母GS115,经G418筛选阳性克隆,并用甲醇诱导表达。SDS-PAGE证实表达的重组蛋白质分子量正确,抑菌试验结果表明重组hLYZ对微球菌具有良好的抑菌效果。说明人溶菌酶基因在毕赤酵母中成功表达。

摘要：为同时在昆虫细胞中按照合适比例表达禽腺联病毒的3个结构蛋白质,首先根据禽腺联病毒VP基因序列设计引物,扩增VP基因,将其克隆至杆状病毒表达载体pFastBac1,获得重组转移载体pFastBac-VP,将其转化到DH10Bac感受态细胞中,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒rBacmid-VP,在脂质体的介导下转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒rBac-VP。SDS-PAGE结果分析表明,3个结构蛋白质VP1、VP2和VP3均获得了表达,分子量正确,且比例为1∶1∶10。Western blot结果显示,表达的重组蛋白质能够与VP3多抗反应。以上结果说明禽腺联病毒的3个结构蛋白质均在昆虫细胞中获得了成功表达。

摘要：为在昆虫细胞中表达鸭源新城疫病毒(NDV)F蛋白,本试验首先根据鸭源NDV F基因序列设计引物,PCR扩增出F基因,将其克隆至杆状病毒表达载体pFastBac1,获得重组转座载体pFastBac-F,将其转化到大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-F,在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBac-F。Western blotting、间接免疫荧光试验结果均显示表达的重组蛋白能与鸭抗NDV阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。结果表明鸭源NDV F蛋白在昆虫细胞中获得了成功表达,为鸭新城疫的预防控制奠定了基础。

摘要：根据Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒(Duck Hepatitis A Virus type-Ⅰ,DHAV-Ⅰ)SH株VP0基因序列设计1对特异性引物,RT-PCR方法扩增出VP0基因,克隆入原核表达载体p ET-32a,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下重组蛋白获得了成功表达。SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白相对分子量约为48 k D,Western-blotting分析表明该蛋白能与His组氨酸单抗发生特异性反应。将目的蛋白切胶纯化后免疫ICR小鼠,制备了针对重组蛋白的多抗血清,Western-blotting分析证明制备的抗血清能够与DHAV-Ⅰ感染的SPF鸡胚尿囊液总蛋白发生特异反应。以上结果表明,VP0基因在大肠杆菌中获得了成功表达,且制备的多抗血清可以用于VP0蛋白的检测。