摘要：目的建立能同时筛查A型、B型和新型甲型H1N1流感病毒的多重RT-PCR技术。方法针对A型流感病毒的M基因、B型流感病毒的NS基因设计通用扩增引物,针对新型甲型H1N1流感病毒的HA基因设计特异性扩增引物,采用一步法建立多重RT-PCR反应体系。通过盲法实验与实时荧光RT-PCR进行比对来评价方法的准确性,并应用于临床评价方法的实用性和有效性。结果琼脂糖凝胶电泳分析多重RT-PCR产物,结果显示目的扩增片段条带清晰明亮,没有非特异性产物出现,可见该方法扩增效率高,特异性强。50份样本的盲法实验结果显示两种方法检测结果完全一致,符合率为100%。结论建立的多重RT-PCR方法能通过一次实验快速、准确地同时筛检A型、B型和新型甲型H1N1流感病毒,是一项成本低廉、对流感的疫情监测和早期诊断具有实用价值的筛检技术。

摘要：目的针对轮状病毒、诺如病毒、星状病毒和扎如病毒四种常见腹泻病毒,建立基于同源加尾(Homo-Tag AssistedNon-Dimer,HAND)系统的一步法四重RT-PCR检测方法。方法根据4种病毒基因组保守序列设计引物并在5'端加上同源尾巴序列。通过优化通用尾巴引物和特异性加尾引物的浓度等PCR参数构建四重RT-PCR反应体系,并系统评价其稳定性、特异性和灵敏度。结果成功建立基于HAND系统的4种腹泻病毒一步法多重RT-PCR检测方法。特异性分析显示四种病毒间无交叉反应,灵敏度分析显示轮状病毒、诺如病毒、星状病毒和扎如病毒的检测下限分别达到48、9.6、1.92和48 pg。结论所建立的基于HAND系统的4种腹泻病毒多重RT-PCR检测方法简便快速、灵敏特异稳定、成本低廉,非常适用于基层医学实验室。

摘要：目的建立阿尼昂尼昂病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法。方法针对阿尼昂尼昂病毒nsP1基因设计特异性引物和探针,以珠海国际旅行卫生保健中心之前构建的MS2病毒样颗粒为标准品,采用一步法建立实时荧光定量RT-PCR检测方法,并对该方法的检测下限、特异性、精密度、抗干扰能力、符合率进行评价。结果建立的阿尼昂尼昂病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法线性良好(线性方程Y=-3.746X+46.174,R2=0.988),检测下限为103copies/mL,低于之前文献报道的检测下限;能特异性地扩增阿尼昂尼昂病毒基因片段,而对其他相关病原体,包括同属于甲病毒属的基孔肯雅病毒、引起类似症状的登革病毒和马雅罗病毒、共用同一媒介宿主的疟原虫等无非特异性扩增;精密度良好,批内精密度测试时Ct值为32.92~35.40,变异系数CV为2.10%;批间精密度测试时Ct值为31.89~35.49,变异系数CV为3.41%;在存在溶血、脂血等干扰因素时Ct值与正常样本的Ct值差值分别为0.37、0.71,表明其能有效对抗溶血、脂血等干扰因素的影响;盲样检测时能检出4例阳性和12例阴性,同预期结果完全一致,阴阳性符合率可达100%。结论本研究建立的检测方法,灵敏度高、特异性好、精密度高、抗干扰能力强,可为阿尼昂尼昂病毒检测提供可行的方法。

摘要：目的研制能同时检测9种常见食源致病菌的96微孔板DNA诊断芯片。方法针对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7(Stx1和Stx2)、志贺氏菌、产单核细胞李斯特菌、蜡样芽胞杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌等9种最常见的食源性致病菌,首先选择合适的保守基因,设计种特异性的PCR引物(5'端标记生物素)和检测探针,通过参数优化建立一管多重PCR扩增体系;然后按5×5的阵列格式将探针点制到96微孔板的微孔内,通过条件优化建立稳定的PCR产物与固化探针的微孔杂交体系;采用链霉抗生物素蛋白碱性磷酸酶和化学显色底物NBT/BCIP来检测特异性的PCR杂交产物。结果20株标准菌株验证已建立的食源致病菌微孔板DNA诊断芯片,获得比较特异和稳定的实验结果。在一起食物中毒事件中,该芯片在采样后12h内检出金黄色葡萄球菌,与传统的细菌分离培养和生化鉴定的结果相符。结论本研究建立的新型食源致病菌96微孔板DNA诊断芯片具有快速、准确、自动化和高通量等特点,为快速应对食物中毒等突发公共卫生事件提供了非常有价值的检测技术。

摘要：目的建立能在野外或现场应用的黄热病毒反转录恒温热隔绝式PCR(reverse transcription-insulated isothermal PCR,RT-iiPCR)快速检测方法。方法针对黄热病毒基因组5’UTR保守区设计检测引物和TaqMan-MGB探针,优化引物、探针、Taq酶、反转录酶和PCR增强剂等各组分的浓度,利用分析平台,建立黄热病毒RT-iiPCR检测方法,评价方法的稳定性、特异性、灵敏度和检测限等指标。结果建立了稳定可靠的黄热病毒RT-iiPCR检测方法,在分析平台上只需一键操作即可在58 min内完成检测并自动报告结果。性能评价试验显示该方法稳定性好,特异性和灵敏度分别达到100.00%和92.31%,检测下限≥1 000拷贝。结论率先建立了黄热病毒RT-iiPCR检测方法,该方法简便实用,适合于现场快速检测。

摘要：目的 建立一种快速、灵敏的丝虫SYBR Green实时荧光聚合酶链式反应(PCR)检测方法,为丝虫病的快速筛查和临床诊断提供实验室依据。方法 根据丝虫基因组保守区域,设计并筛选特异性引物。对引物浓度、荧光染料浓度及扩增条件进行优化,建立丝虫SYBR Green实时荧光PCR检测方法,并对其检测下限、特异性、抗干扰能力、重复性和亚型检测能力等进行评估。结果 本研究建立的丝虫SYBR Green实时荧光PCR检测方法能对感染人的5种丝虫(班氏丝虫、马来丝虫、盘尾丝虫、罗阿丝虫、帝汶丝虫)进行特异性扩增,与其他相近寄生虫(锥虫等)无交叉反应。该方法的检测下限为500 fg,批内精密度测试循环阈值(Ct值)为32.37~33.03,均值为32.73,标准差为0.20,变异系数(CV)为0.61%。干扰试验中,存在干扰因素样本的Ct值与正常样本的Ct值差值分别为0.79(溶血)、0.78(脂血)、0.29(乳糜尿)、0.51(腐败蚊体),表明该方法能有效对抗溶血、脂血、乳糜尿、腐败蚊虫组织等干扰因素的影响。结论 本研究建立的SYBR Green实时荧光PCR方法具有特异性强、敏感度高、重复性好以及抗干扰能力强的优点,是一种快速检测丝虫的可行方法。