摘要：目的探讨经外源性血管内皮生长因子(VEGF)处理的大鼠表皮干细胞(ESC)对深Ⅱ度烧伤大鼠创面愈合的影响及机制。方法从1只3个月龄雌性SD大鼠躯干皮肤分离获得ESC,取第3代对数生长期细胞进行实验(1)^(3)。(1)取细胞,采用角质形成细胞专用无血清培养基(K-SFM)常规培养(常规培养条件下同),于倒置光学显微镜下观察培养3、5 d细胞形态。(2)取细胞常规培养24 h,流式细胞仪检测细胞表面标志物CD44、CD45、CD11b和CD11c的表达,样本数为3。(3)取4个批次细胞,各批次细胞均采用随机数字表法分为空白对照组和VEGF组。空白对照组细胞常规培养,VEGF组细胞用含终质量浓度为10 ng/mL VEGF的K-SFM培养。1个批次细胞培养10 d,采用蛋白质印迹法检测细胞角蛋白19(CK19)、CK10蛋白表达;1个批次细胞培养0(即刻)、2、4、6、8、10 d,分别取细胞采用实时荧光定量反转录PCR法检测Nanog mRNA表达;1个批次细胞培养2、4、6、8、10 d,分别取细胞采用细胞计数试剂盒8测定吸光度值;1个批次细胞培养10 d,光学显微镜下观察计数>50个细胞的克隆数,计算细胞克隆形成率。各批次细胞各时间点样本数均为3。(4)选取36只3个月龄雌雄不限SD大鼠,用100℃铁质圆片在每只大鼠背部两侧压迫10 s制作2个直径为10 mm的深Ⅱ度烫伤(下称烧伤)创面。按随机数字表法将致伤大鼠分为VEGF+ESC组、单纯ESC组及空白对照组,每组12只大鼠、24个创面。伤后0(即刻)~2 d,3组大鼠每个创面均每天一次性注射20μL磷酸盐缓冲液(PBS),其中VEGF+ESC组PBS中含0.8×10^6个/mL经10 ng/mL VEGF处理10 d的ESC、单纯ESC组PBS中含0.8×10^6个/mL未经任何处理的ESC、空白对照组PBS中不含任何其他物质。于首次注射后(下称注射)0(即刻)、3、7、14 d,先按随机数字表法于每组分别取3只大鼠观察并记录创面愈合情况,计算注射3、7、14 d创面愈合率;随后处死各时间点大鼠切取创面组织行苏木精-伊红染色,行组织学观察。对数据行独立样本t检验、析因设计方差分析、LSD检验、Bonferroni校正。结果(1)培养3 d细胞呈集群分布,细胞集群生长缓慢;培养5 d集群大而圆,集群内细胞主要为细胞核大而圆、胞质少的细胞,符合ESC形态特征。(2)细胞表面CD44阳性表达率为(94.3±1.2)%,CD45、CD11b、CD11c呈阴性表达。细胞鉴定为ESC。(3)培养10 d,与空白对照组比较,VEGF组细胞CK19蛋白表达水平明显升高(t=3.756,P0.05),培养4、6、8、10 d Nanog mRNA表达量和培养6、8、10 d吸光度值均明显升高(t=6.34、5.00、5.58、4.61,5.65、10.78、15.51,P0.05);单纯ESC组大鼠注射7、14 d创面愈合率分别为(26.0±2.0)%、(64.4±4.7)%,明显高于空白对照组的(12.4±1.1)%、(29.1±3.3)%(P<0.01),2组均明显低于VEGF+ESC组的(41.0±2.4)%、(91.3±3.5)%(P<0.01)。注射3 d,VEGF+ESC组大鼠创面可见大量炎性细胞浸润,早于其余2组;注射7 d,VEGF+ESC组大鼠创面可见大量内皮细胞,单纯ESC组大鼠创面可见部分内皮细胞增殖,空白对照组大鼠创面可见大量炎性细胞浸润;注射14 d,VEGF+ESC组大鼠创面新生表皮细胞基本覆盖创面,单纯ESC组大鼠创面新生表皮细胞覆盖大部分创面,空白对照组大鼠创面基底可见大量内皮细胞且新生表皮细胞覆盖部分创面。结论经外源性VEGF处理的大鼠ESC可促进深