摘要：目的克隆G250启动子并插入pGL3-Basic真核表达载体，探讨G250启动子在肾癌细胞中的特异生物活性。方法提取宫颈癌Hela细胞总DNA作为模板，设计两对引物进行PCR，获取两段不同长度的G250启动子片段。测序后分别将获取的551bp和218bp启动子片段克隆到pGL3-Basic载体中，构建双荧光素酶检测质粒pGLB-G551和pGLB-G218。将pGL3-Basic、pGLB-G551、pGLB-G218各μg转染G250阳性宫颈癌Hela细胞、肾癌Ketr-3细胞。运用双荧光素酶检测技术，确定G250启动子的转录活性。结果电泳与测序结果显示，两段G250启动子片段与报道序列一致。酶切与测序结果显示，质粒pGLB-G551、pGLB-G218构建成功。转染pGLB-G551、pGLB-G218的Hela细胞相对荧光素酶活性分别为pGL3-Basic的11．07倍、10．36倍。Ketr-3细胞分别为pGL3-Basic的5．17倍、4．13倍。与空载体***比较，pGLB-G551和pGLB-G218的相对荧光素酶活性均明显增强（P〈0．05）。pGLB-G551和pGLB-G218比较，相对荧光素酶活性差异无统计学意义（P〉0．05）。结论成功克隆出肾癌特异性G250启动子，并证明具有良好转录活性，218bp的启动子片段已具有G250启动子的所有启动效果。

摘要：目的:构建针对肿瘤增殖基因Ki67的小干扰RNA(Ki67-siRNA)腺病毒表达载体,体外研究其对人结肠癌细胞株SW620细胞生长影响,为结肠癌的基因治疗提供参考。方法:设计可形成小发夹结构的Ki67-siRNA对应模板DNA序列,克隆至缺陷型腺病毒质粒pCA13,构建Ki67-siRNA表达质粒pCA13-Ki67。鉴定正确后,将pCA13-Ki67与含有腺病毒右臂的质粒pBHGE3共转染至293细胞,包装成复制缺陷型腺病毒Ad-Ki67。大量扩增Ad-Ki67,氯化铯梯度离心纯化,测病毒滴度。Ad-Ki67感染人结肠癌细胞,结晶紫染色法检测细胞病理作用,MTT法检测细胞存活,Western印迹法检测Ki67表达。结果:酶切分析、测序鉴定表明pCA13-Ki67构建成功,PCR分析表明Ad-Ki67含有Ki67-siRNA序列。Ad-Ki67可显著抑制Ki67蛋白表达及结肠癌细胞生长。结论:含有Ki67-siRNA的重组腺病毒构建成功,其能抑制人结肠癌细胞Ki67基因表达和生长。

摘要：目的构建大鼠FasshRNA真核表达重组质粒，并检测其对NRK-52E细胞（大鼠肾小管上皮细胞）Fas基因的沉默效率，筛选出一个最有效干扰质粒。方法按照siRNA设计原则，在大鼠Fas基因mRNA上挑选4个干扰靶序列，再根据靶序列分别设计并合成两端含有酶切位点的总长度为64bp的shRNA转录模板DNA正、反义寡核苷酸链，并将其退火后克隆至空载体pSliencerTM3．1～H1 neo siRNA Expression Vector中，对其进行鉴定。用Lipofectamine LTX Reagent将pSilencer Fas（1～4）4个重组质粒转染至大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）内，以pSilencer—EGFP shRNA和pEGFP—N1质粒共转染做阳性对照，经过G418压力性筛选后，使用RT—PCR和蛋白免疫印迹法分析针对Fas基因构建的4个重组质粒的有效性，筛选出最有效的干扰质粒。结果pSilencer-Fas（1～4）shRNA及pSilencer—EGFPshRNA重组质粒测序结果与预期序列相同。RT—PCR及蛋白免疫印迹结果显示pSilencer—Fas4shRNA对Fas基因在mRNA水平和蛋白水平的抑制率均最高，分别达到（78．9±3．2）％和（64．5±4．62）％。结论利用RNA干扰技术沉默大鼠Fas基因，可以降低大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）Fas的表达。

摘要：目的构建肿瘤增殖基因Ki-67小干扰RNA(siRNA)表达质粒,研究其对人肾癌细胞Ki-67基因表达的阻抑作用,探索肾癌基因治疗新的途径。方法设计有小发夹机构的2条Ki-67siRNA对应模板DNA序列,煺火处理后克隆至pSliencer3.1质粒,构建重组质粒pSliencer-Ki-67。将pSliencer-Ki-67转染人肾癌786-0细胞,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Westernblot检测Ki-67表达。结果酶切及测序证实质粒pSliencer-Ki-67构建成功。其可显著抑制786-0细胞Ki-67mRNA、Ki-67蛋白表达。结论成功构建的Ki-67siRNA表达质粒pSliencer-Ki-67能抑制人肾癌786-0细胞Ki-67基因表达。

摘要：[目的]探讨白细胞介素-15(IL-15)联合CIK细胞治疗裸鼠肾癌移植瘤的效果及其作用机制。[方法]建立裸鼠肾癌皮下移植瘤模型,采用析因设计方法,随机分4组,Ⅰ组对照组(n=8),瘤旁注射生理盐水0.2ml/只;Ⅱ组(n=8),瘤旁注射CIK细胞0.2ml/只(约3×107个CIK细胞);Ⅲ组(n=8),瘤旁注射IL-15 0.2ml/只(约100μg/kg);Ⅳ组(n=8),瘤旁注射IL-15 0.2ml/只(约100μg/kg)和CIK细胞0.2ml/只(含约3×107个CIK细胞),注射方案:1次/周,连续3周。观察裸鼠生存期、生存延长率及肿瘤生长曲线。待裸鼠死亡后,观察移植瘤细胞凋亡率,NK细胞群计数;测定裸鼠脾脏重量;对裸鼠移植瘤常规病理学检查。[结果]实验组与对照组相比荷瘤裸鼠生存延长率,脾脏重量,移植瘤细胞凋亡率,NK细胞群计数均有明显差异。病理学检查示CIK组、IL-15组与对照组肿瘤细胞形态上无明显差别,可见少量肿瘤坏死,但联合治疗组可见较多肿瘤坏死,肿瘤细胞周围及肿瘤内有大量淋巴细胞浸润。[结论]IL-15联合CIK细胞对裸鼠肾癌移植瘤生长有明显的抑制作用,且较IL-15或者CIK细胞单一治疗效果更好。其机制可能与IL-15诱导CIK细胞(含NK细胞、NK-T细胞及CD8+记忆T细胞)的发育、增殖及活化,进一步促进机体免疫细胞活性及细胞因子反应,免疫性增强有关。

摘要：目的利用CT尿路造影(CTU),结合3D打印技术,数字化设计,研制个体化经皮肾镜碎石取石术(PCNL)穿刺导板,初步探讨其应用于PCNL穿刺定位的可行性。方法选取2017-2018年徐州医科大学附属医院22例拟行经PCNL的肾结石患者,其中实验组10例,利用3D打印技术制作导向器(穿刺导板),在体外进行模拟穿刺,明确进针角度后对10例患者进行PCNL;对照组12例,利用彩超定位穿刺点进行PCNL。比较两组穿刺定位的准确性、穿刺时间、术中出血量。结果实验组10例患者术中穿刺导板与患者皮肤均贴合良好,在导板引导下行穿刺针穿刺并且经过彩超的验证1针穿刺成功率100.00%(10/10),进针点的定位及穿刺的深度、角度均与术前设计的方案一致;对照组12例彩超定位穿刺1针穿刺成功率75.00%(9/12),两组比较无统计学意义(P>0.05);实验组穿刺时间、术中出血量分别为(7.78±0.94)min、(49.31±6.43)mL,对照组分别为(9.04±1.09)min、(60.08±12.18)mL,两组比较有统计学意义(P<0.05)。结论3D打印个性化经皮肾镜穿刺导板能够提高PCNL肾脏穿刺通道定位的准确性,缩短了穿刺时间减少了术中出血量,为PCNL的肾脏穿刺定位提供了一种新的方法,值得临床进一步探讨研究。