摘要：目的建立一种基于反转录重组酶介导的等温扩增(reverse transcription recombinase-aid amplification,RT-RAA)联合CRISPR/Cas12a反应的人副流感病毒(human parainfluenza virus,HPIV)核酸检测方法。方法根据HPIV核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,N)基因保守区序列,设计RT-RAA所需型特异性引物及crRNA(CRISPR RNA,crRNA),应用Cas12a切割荧光标记探针产生的荧光强度筛选高敏感性HPIV1-4型特异性crRNA并优化crRNA、Cas12a和探针浓度。利用体外转录RNA及临床样本,评价RT-RAA联合CRISPR/Cas12a检测方法的检测下限及特异性。结果从设计的crRNA中筛选出高敏感性的HPIV1-4型特异性crRNA,并建立基于荧光强度测量的RT-RAA联合CRISPR/Cas12a的HPIV核酸检测方法,该方法对各型HPIV的检测下限均可达到10拷贝/反应。采用该方法检测8种其他呼吸道病毒感染的临床样本,均未显示有交叉反应。结论建立的HPIV 1-4型荧光法CRISPR核酸检测方法快速、特异,且可无需专业核酸检测设备。

摘要：目的应用反转录重组酶介导等温扩增(reverse transcription recombinase-aid amplification,RT-RAA)联合CRISPR体系,建立人副流感病毒(human parainfluenza virus,HPIV)核酸检测方法。方法根据HPIV-1核衣壳蛋白(nucleocapsid,N)基因保守区序列,设计RT-RAA所需型特异性引物及crRNA(CRISPR RNA),应用Cas13a切割荧光标记探针产生的荧光强度优化crRNA和Cas13a浓度。利用体外转录RNA及临床样本,评价RT-RAA联合CRISPR/Cas13a检测方法的检测下限、敏感性和特异性。结果RT-RAA联合CRISPR/Cas13a方法对HPIV-1的检测下限可达到1拷贝/反应,该方法检测HPIV-2~4及8种其他呼吸道病毒感染的临床样本,均未显示有交叉反应;该检测方法的灵敏度(100%)和特异度(97.8%)高,与商业化试剂盒比较,具有较高的检测一致率(Kappa=0.88)。结论联合应用RT-RAA和CRISPR/Cas13a技术,成功建立HPIV-1核酸检测方法,该方法具有快速、灵敏和特异的特点,且无需专业核酸检测设备。

摘要：目的建立基于多重PCR的人3型腺病毒(human adenovirus 3,HAdV-3)全基因组高通量测序方法,提高HAdV-3全基因组测序效率和成功率。方法设计适用于HAdV-3全基因组扩增的多重PCR引物,通过多重PCR扩增HAdV-3全基因序列,使用琼脂糖凝胶电泳初步验证扩增产物的特异性。使用Illumina二代测序对多重PCR产物进行高通量测序。获得序列后使用CLC、IGV等软件分析测序有效数据量、平均深度及全基因组覆盖度等质量参数,评估测序质量。基于全基因组测序结果构建系统发育树,确认病毒型别及分析序列的同源性,评价该方法的准确性。结果设计得到HAdV-3全基因组多重PCR扩增引物共计70条(35对),扩增子大小约1200 bp,预期基因组全长约35240 bp、全基因组覆盖度可达99.8%;电泳结果显示多重PCR产物大小与预期相符且扩增特异性高;高通量测序结果显示基于该方法所获病毒全基因组序列完整无缺失,基因组覆盖度达预期范围;序列质量分析显示基于多重PCR的高通量测序方法能获得更多有效数据和更大测序深度,全基因组覆盖更均匀;进化分析显示病毒DNA经多重PCR扩增再测序与病毒DNA直接测序所获序列的进化分型结果一致且同源性高,表明该多重PCR方法的扩增忠实性高,结合高通量测序所获序列结果准确。结论本研究成功建立了一种基于多重PCR的HAdV-3全基因组高通量测序方法,该方法能够提高HAdV-3全基因测序效率和成功率,旨在为基于全基因组测序的HAdV-3病原监测及疫情溯源提供更好的技术支持与参考。

摘要：代谢网络在代谢功能研究、生物代谢过程控制、疾病诊断分析和药物靶标设计等方面具有重要理论和实践意义。生物信息学研究利用序列同源、结构模拟、对接等手段与生化实验有效结合促进了生物体代谢网络的进一步完善。本文作者在构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori 26695,*** 26695)代谢网络的工作基础上综合了近年来研究者对*** 26695代谢通路关键酶的研究成果,并结合基因组信息,综述了*** 26695特异性的重要代谢通路。本文从基因组水平阐明代谢通路与基因的关系,并详细分析了关键酶对*** 26695生理的重要作用,最后探讨了重构一个连续、完整的代谢网络面临的困难及其在药物靶标设计方面的研究前景。